二甲双胍联合化疗药物对人胃癌AGS细胞的作用*

吴诗文,张自森,刘 谦,王世超,司远方,赵胜男，夏兴洲#

1)郑州大学第五附属医院消化内科 郑州 450052 2)郑州大学第五附属医院肿瘤科 郑州 450052

二甲双胍联合化疗药物对人胃癌AGS细胞的作用*

吴诗文1),张自森2),刘 谦1),王世超1),司远方1),赵胜男1)，夏兴洲1)#

1)郑州大学第五附属医院消化内科 郑州 450052 2)郑州大学第五附属医院肿瘤科 郑州 450052

#通信作者，男，1964年9月生，硕士，主任医师，研究方向：胃癌的临床基础研究，E-mail:Zhougxia@163.com

二甲双胍；胃癌；顺铂；阿霉素；紫杉醇

目的：探讨二甲双胍(Met)联合化疗药物对人胃癌AGS细胞的影响。方法：应用Met及其分别联合顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、紫杉醇(PTX)处理人胃癌AGS细胞，应用CCK-8、Transwell模型、流式细胞术检测细胞增殖、迁移能力、侵袭能力及细胞凋亡。结果：Met可呈时间-剂量依赖性抑制AGS细胞增殖(P均<0.001)，IC50为10 mmol/L。10 mmol/L Met、2 mg/L的DDP、0.02 mg/L的ADM、0.02 mg/L的PTX单用均可降低AGS细胞的迁移、侵袭能力，促其凋亡(P均<0.05)，Met可协同3种化疗药物促进AGS细胞凋亡(P<0.05)。结论：Met有望用于胃癌的辅助化疗。

近年来研究[1-4]发现二甲双胍(metformin,Met)能够抑制多种肿瘤细胞的生长，其抗肿瘤作用得到了广泛关注。胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率及病死率均较高，目前氟尿嘧啶类、铂类联合蒽环类或紫杉醇类仍是胃癌化疗的基础用药。该研究观察了Met联合化疗药物顺铂(cisplatin,DDP)、阿霉素(doxorubicin,ADM)、紫杉醇(paclitaxel,PTX)对人胃癌AGS细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响，初步探讨Met联合化疗药物对人胃癌的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌AGS细胞购自上海细胞库。Met购自Sigma公司，ADM购自辉瑞制药公司,DDP购自山东齐鲁制药公司，PTX购自FH科鼎有限公司，F-12K培养基购自吉诺生物医药公司，Met、DDP、ADM、PTX用F-12K培养基配成1 g/L的储存液，-20 ℃保存备用。胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物公司，胰酶购自碧云天公司，牛血清白蛋白(BSA)购自Solarbio公司，磷酸盐缓冲液(PBS)购自Hyclone公司。CCK-8试剂盒购自日本同仁公司，Transwell小室购自Coming Costor公司，Matrigel基质膜购自Corning公司,Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、PI细胞周期检测试剂盒、流式细胞仪为BD公司产品。

1.2 实验分组 AGS细胞用含体积分数10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的F-12K培养基于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。Met单用组：选用不同浓度Met处理细胞；化疗药物单用组：分别应用DDP(2 mg/L)、ADM(0.02 mg/L)、PTX(0.02 mg/L)单独处理细胞；联合用药组：DDP、ADM、PTX分别与Met联合处理细胞。DDP、ADM、PTX对AGS细胞的IC50分别为2、0.02和0.02 mg/L。所有实验均重复3次。

1.3 观测指标

1.3.1 细胞增殖抑制率 取对数生长期的AGS细胞，调整细胞密度为1×104mL-1，200 μL/孔接种于96孔板，待细胞贴壁，按1.2 Met单用组处理细胞，Met浓度分别为0.0(空白对照)、5.0、10.0、12.5、15.0、17.5和20.0 mmol/L,每个浓度设6个复孔。培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h，用酶联免疫检测仪测450 nm处的吸光度(A)。增殖抑制率=(对照A-实验A)/对照A×100%。

1.3.2 细胞迁移能力 AGS细胞饥饿培养24 h后，用含1 g/L BSA的无血清培养基重悬计数，将200 μL浓度为1×105mL-1细胞悬液种植于Transwell小室(24孔板)，分组处理细胞，下室加500 μL体积分数10%FBS的培养液。待细胞迁移20 h后，擦去上层细胞，体积分数40%甲醛固定20 min，1 g/L结晶紫染色15～20 min。倒置显微镜(×200)下随机取6～8个视野，计数穿膜细胞数，计算平均值。

1.3.4 细胞凋亡 细胞分组处理48 h后，用含20 g/L BSA的胰酶消化，2 000 r/min离心5 min，PBS洗涤细胞2次，用1×Binding Buffer液制成1×106mL-1的悬液，取500 μL，加入5 μL AnnexinV-FITC室温避光孵育15 min，加入5 μL PI室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测，结果用Novo Express软件分析。

1.4 统计学处理 应用SPSS 21.0进行统计学分析。Met对AGS细胞增殖抑制率的影响、Met单用及与化疗药物联用对AGS细胞迁移能力、侵袭能力、凋亡影响的比较采用析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Met对AGS细胞增殖的影响 Met对AGS细胞的增殖有抑制作用，且呈时间和剂量依赖性(表1)。Met作用72 h对AGS细胞增殖抑制的IC50为10 mmol/L，故后续实验均在此浓度进行。

表1 Met对AGS细胞的增殖抑制率测定结果(n=3) %

F剂量=517.930，F时间=488.541，F交互=15.930，P均<0.001。

2.2 Met单独和联合化疗药物对AGS细胞迁移能力的影响 Transwell迁移实验结果见图1、表2。由表2可以看出，Met、DDP、ADM、PTX单独应用均可降低AGS细胞的迁移能力，但Met与化疗药物联用对AGS细胞迁移能力的影响并无协同作用。

2.3 Met单独及联合化疗药物对AGS细胞侵袭能力的影响 Transwell侵袭实验结果见图2、表3。从表3可以看出，Met、DDP、ADM、PTX单独应用均可降低AGS细胞的侵袭能力，但Met与化疗药物联用对AGS细胞侵袭能力的影响并无协同作用。

2.4 Met单独及联合化疗药物对AGS细胞凋亡的影响 凋亡结果见图3、表4。从表4可以看出，Met、DDP、ADM、PTX单独应用均可增加AGS细胞的总凋亡细胞比例，且Met与DDP、ADM、PTX联用时均存在协同效应。

A:空白对照组；B、C、D、E：分别为DDP、ADM、PTX、Met单用组；F、G、H：分别为Met与DDP、ADM、PTX联合用药组。图1 Met单独及联合化疗药物对AGS细胞迁移能力的影响(结晶紫染色，×200)

c(Met)/(mmol·L-1)细胞数/(个·视野-1)不联合化疗药物联合DDP联合ADM联合PTX0148．3±30．4100．3±14．679．3±13．173．3±14．31091．7±17．060．7±7．251．3±8．543．7±8．3

DDP：FMet=18.845,P=0.002，FDDP=12.674，P=0.007，F交互=0.587,P=0.466；ADM：FMet=14.797，P=0.005，FADM=24.675，P=0.001，F交互=1.696，P=0.229；PTX：FMet=15.064，P=0.005，FPTX=30.577，P=0.001，F交互=1.473，P=0.259。

A:空白对照组；B、C、D、E：分别为DDP、ADM、PTX、Met单用组；F、G、H：分别为Met与DDP、ADM、PTX联合用药组。图2 Met单独及联合化疗药物对AGS细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色，×200)

c(Met)/(mmol·L-1)细胞数/(个·视野-1)不联合化疗药物联合DDP联合ADM联合PTX0105．7±11．070．0±7．067．0±9．556．0±8．91062．0±6．642．7±4．040．7±6．732．3±5．0

DDP：FMet=65.848、FDDP=39.514，P均<0.001，F交互=3.485,P=0.099；ADM：FMet=49.055、FADM=36.040，P均<0.001，F交互=3.008，P=0.121；PTX：FMet=50.625、FPTX=70.278，P均<0.001，F交互=4.467，P=0.068。

上图从左至右：空白对照组，DDP、ADM、PTX单用组；下图从左至右：Met单用组，Met与DDP、ADM、PTX联合用药组。图3 流式细胞术检测Met单独及联合化疗药物对AGS细胞凋亡的影响

c(Met)/(mmol·L-1)总凋亡细胞比例/%不联合联合DDP联合ADM联合PTX04．4±1．336．3±3．023．1±2．232．7±2．61030．3±3．748．0±2．041．6±1．748．4±2．0

DDP：FMet=151.170、FDDP=261.409，P均<0.001，F交互=21.212，P=0.002；ADM：FMet=260.774、FADM=118.152，P均<0.001，F交互=7.017，P=0.029；PTX：FMet=202.444、FPTX=251.014，P均<0.001，F交互=12.119，P=0.008。

3 讨论

Met作为一种2型糖尿病治疗的一线和基础用药，具有稳定的疗效及良好的安全性[5-6]。Met是一种腺苷酸活化蛋白激酶激动剂，可调节AMPK信号通路[7]。大量研究[8-11]发现Met能降低癌症发生的风险，抑制肿瘤细胞的生长，但在不同类型的肿瘤细胞中分子机制可能不同。胃癌是我国常见的恶性肿瘤，化疗仍是胃癌的重要治疗手段。临床上抗肿瘤治疗中为了达到理想的效果，不得不加大化疗药物的用量，然而在加大药量的同时必然会加重化疗药物的毒副作用。该研究发现Met可以有效抑制AGS细胞的增殖，抑制其迁移、侵袭能力，促进其凋亡；Met还可协同DDP、ADM、PTX促进AGS细胞的凋亡。Met仅在促凋亡作用中呈现出与化疗药物的协同效应，可能是因为Met与DDP、ADM、PTX存在相同的促凋亡机制，同时也提示Met即使对同一类型胃癌细胞的作用机制也不尽相同，对AGS细胞迁移和侵袭的影响与促进凋亡的分子机制不同，而这些机制可能与Met复杂的作用特性有关[12-15]。

然而尽管在该实验中Met显示了良好的抗癌效力，甚至与3种化疗药物都存在一定程度的协同作用，但亦有研究[16]显示在某些癌细胞中Met并不能提高化疗药物的抗癌效力。国内研究[17-18]也发现Met联合5-FU对AGS细胞的抑制作用呈协同效应，但在MNK-45细胞系中却无此作用，甚至有报道[19]显示Met与DDP存在拮抗作用，Uehara等[20]还发现Met与DDP联用时在缺氧与含氧量正常两种情况下作用效果不同。这也进一步说明Met与化疗药物联用的机制十分复杂，可能与化疗药物的种类、肿瘤细胞的类型都有关系，有待进一步研究。

综上所述，Met联合化疗药物可以协同发挥促AGS细胞凋亡的作用，但其作用机制尚不十分明确；Met有望成为一种新型的胃癌辅助化疗药物。

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(2016-06-04收稿 责任编辑王 曼)

Effect of metformin combined with chemotherapeutic agents on gastric cancer cell line AGS

WUShiwen1),ZHANGZisen2),LIUQian1),WANGShichao1),SIYuanfang1),ZHAOShengnan1),XIAXingzhou1)

1)DepartmentofGastroenterology,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOncology,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

metformin;gastric cancer;cisplatin;doxorubicin;paclitaxel

Aim: To investigate the effect of metformin(Met) combined with chemotherapeutic agents on human gastric cancer cell line AGS. Methods: AGS cells were treated with Met alone or in combination of cisplatin(DDP), doxorubicin(ADM) or paclitaxel(PTX).CCK-8, Transwell, and flow cytometry were used to detect cell proliferation, migration, invasion and apoptosis. Results: Met could inhibit cell proliferation in a dose- and time-dependent manner(P<0.001), andIC50was 10 mmol/L. 10 mmol/L Met,2 mg/L DDP,0.02 mg/L ADM,0.02 mg/L PTX separate application could decrease the migration, invasion capabilities and prompt apoptosis of AGS cells(P<0.05), and Met had synergistic effected when being used with DDP, ADM or PTX in cell apoptosis(P<0.05). Conclusion: Met might be used for adjuvant chemotherapy for gastric cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.010

*河南省医学科技攻关计划项目 201403126

R735.2