荧光定量聚合酶链反应技术在结核病诊断中的应用价值探讨

陆飞越+建华+仁其+婷婷+良平

结核病是由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的慢性传染病，对疑似结核病人进行痰抗酸杆菌涂片染色镜检及分枝杆菌培养，直接找到病原菌，对诊断结核病具有重要意义。但上述两种方法也有其局限性：涂片镜检法总的敏感性为22%～80%[1]，并且无法在镜下区分与MTB形态、染色相同的非结核分枝杆菌（NTM），而NTM 与MTB一样严重威胁人类健康[2-3]。分枝杆菌培养法是临床诊断结核病的“金标准”，但该方法灵敏度也不够高，阳性率约为40%～60%[4]，并且该法检测周期长，从培养至菌种鉴定一般需要8周甚至更长，且对早期结核菌感染者、药物治疗后细胞壁缺损L型细菌难以检出。为此，找到一种适合基层医疗单位应用，并能快速、灵敏诊断结核病，有效区分MTB与NTM的实验室诊断方法，在临床上有重要应用价值。荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）是一种在聚合酶链反应（PCR）体系中引入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR扩增进程的方法，可对标本中起始DNA模板进行定量，提高检测灵敏度，同时省去了电泳步骤，减少污染机会，特异性更好。FQ-PCR结果以循环阈值（Ct值）表示， Ct值越小，说明起始模板核酸浓度越高。本研究试图应用FQ-PCR法检测痰标本中MTB，以为临床提供一种快速、灵敏、特异的结核病辅助诊断方法。

1 材料与方法

1.1标本来源

分批收集自2013年5月—2014年6月，在平湖市第一人民医院（结核病定点诊断医院）留取的经抗酸杆菌涂片染色镜检阳性，且同时开展了分枝杆菌培养的合格痰标本共计115份，冻存于-20℃冰箱供FQ-PCR法检测MTB使用。

1.2仪器与试剂

仪器有安捷伦公司的MX3000P实时荧光定量PCR仪、贝克曼库尔特高速冷冻离心机、生物安全柜、-80℃超低温冰箱等。试剂为中山大学达安基因股份有限公司的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光法），针对结核分枝杆菌特异性插入序列6110（IS6110）进行检测，所有试剂均在有效期内使用。

1.3方法

用4% 氢氧化钠对样本进行前处理，提取核酸，上机进行PCR扩增及荧光检测，之后分析检测结果。扩增条件：93℃持续2 min预变性，93℃ 45s→55℃ 60s循环10次，之后93℃ 30s→55℃ 45s循环30次，设置55℃用FAM通道检测荧光信号。

1.4结果判断

阴性对照品无S型扩增曲线，阳性对照品扩增呈S型曲线，样本Ct值=30或无数值判为阴性，样本扩增呈S型曲线，且Ct值<30判为阳性。

1.5统计学分析

将不同方法检测结果录入Excel数据库，运用SPSS 16.0软件进行统计学分析。

2 结果

本次收集的115份痰涂阳标本中，用FQ-PCR法检测，检出MTB阳性106份，阳性率为92.2%；用改良罗氏培养法培养，经PNB/TCH试验鉴定为MTB的87份，阳性率为75.7%，用SPSS 16.0软件进行卡方检验，两者差异有非常显著的统计学意义（χ2=11.63，P<0.001），见表1。

115份痰涂阳标本中，FQ-PCR法检测MTB结果有9份阴性，占7.8%（9/115）。115份痰涂阳标本中，用改良罗氏培养法培养，结果分枝杆菌阳性97份，阳性率为84.35%，其中经PNB/TCH试验鉴定为NTM的10份，占培养阳性数的10.3%（10/97）， 占涂阳数的8.7%（10/115）；培养结果分枝杆菌阴性16份，报告污染杂菌的2份。用改良罗氏培养法培养，经PNB/TCH试验鉴定为NTM的10份标本中，FQ-PCR法检测MTB结果阴性4份，阳性6份；FQ-PCR法检测MTB结果阴性的9份标本中，除4份培养鉴定为NTM外，3份培养结果阴性，2份培养结果MTB阳性。

3 讨论

本研究结果表明，用FQ-PCR法检测115份痰涂阳标本，检出MTB阳性106份，阳性率为92.2%；而用改良罗氏培养法鉴定，结果MTB阳性87份，阳性率为75.7%，两者差异有非常显著的统计学意义。表明FQ-PCR法检测MTB是一种快速、灵敏的检测方法，对于临床早期诊断结核病具有重要的应用价值。按照0.05 mL痰涂片成200 mm2的标本膜，用100×油镜观察，每片约有5 000个视野，而镜检结果为1+的报告标准为3～9条/100视野，按此计算，镜检结果1+的痰含菌量至少在3 000条/mL。另一方面，FQ-PCR法的检测灵敏度为10个菌即可检出（达安基因提供）。在此基础上，结合分析痰涂片结果及FQ-PCR检测结果，对痰涂片结果抗酸杆菌阳性，特别是菌量在1+以上的，而FQ-PCR法检测MTB阴性的情况，极有可能为NTM感染，将上述两种方法的结果结合进行分析，对于基层不具备分枝杆菌基因分型条件的医疗单位早期诊断NTM感染具有一定意义。

本研究结果显示，用FQ-PCR法检测115份涂阳痰标本，有9份NTM阴性（涂片结果阳性而FQ-PCR法结果阴性），占涂阳标本数的7.83%，培养法鉴定有10份NTM阳性，占涂阳标本数的8.70%。据梁莉等[5]报道，上海市1998—2004年NTM感染占分枝杆菌属培养阳性率分别为1.49%、1.17%、1.98%、2.46%、2.66%、2.72%、3.00%，基本呈上升趋势。陕西省结核病防治院王智存、邹远妩等[6-7]报道，陕西省2012—2013年NTM感染占分枝杆菌培养阳性率为7%～16.9%。本次研究结果显示，平湖地区NTM感染占分枝杆菌培养阳性率为10.3%，表明NTM感染在平湖市分枝杆菌肺病中占有一定比例，NTM的大多数菌种对治疗MTB的药物呈现高耐药[5-10]，容易导致临床治疗失败。快速、准确区分MTB与NTM感染对于结核病的诊治非常必要，对于FQ-PCR法提示为NTM感染的肺病病人，建议及早开展菌型鉴定及药物敏感性试验以便进行进一步的治疗。

本次研究结果中，痰培养结果阳性，而实时荧光定量PCR法阴性的2份标本，除了检测方法灵敏度因素外，还可能与检测时取痰样的部位有关，另据文献报道，在国内发现有IS6110单拷贝和零拷贝结核分枝杆菌菌株[11]，而本次研究中所用实时荧光定量PCR法检测的靶序列即为IS6110，这也可能是导致实时荧光定量PCR法检测结果阴性的因素之一。

FQ-PCR法阳性而培养鉴定法阴性的21份标本中，除了10份鉴定为NTM外，剩余的11份可能与培养法的灵敏度及培养过程中污染杂菌有关，也有可能与痰中的抗酸杆菌是死菌有关。本次研究结果中，经培养及PNB/TCH试验鉴定，属于NTM的10份标本，其中6份实时荧光定量PCR法检测结果为结核分枝杆菌阳性，可能存在混合感染，导致痰培养时只有优势菌种生长。此外，由于菌种鉴定使用的是PNB/TCH试验，未最终鉴定到种的水平，根据浙江省疾病预防控制中心柳正卫等[12]报道，用DNA微阵列芯片法和16sRNA测序法对70株PNB/TCH试验初步鉴定为NTM的菌株进行菌种鉴定，结果61.43%为结核分枝杆菌，其余38.57%为NTM。李国利等[13]报道，以PCR-反向核酸探针杂交和PCR-DNA测序结果为鉴定标准， 264株NTM菌株中233（88% ）株PNB生长试验为阳性， 其余31株（12% ）为阴性，认为仅应用PNB生长试验鉴别结核分枝杆菌与NTM存在局限性。

参考文献

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基金项目：平湖市科技发展计划项目（2012-62）

【作者简介】陆飞越（1979—），女，副主任技师 （收稿日期：2015-04-29）