流感病毒致继发性细菌感染的易感机制研究进展

史庆丰+姜晨彦+蒋露芳

肺炎是全球传染性疾病最主要的死因之一，每年导致全球数百万人死亡，在5岁以下儿童和60岁以上老年人中具有更高的发病率和死亡率。在中国每年约有250万新发肺炎病例，研究估算约有5%的患者死于肺炎相关疾病[1]。尽管目前已有疫苗接种和抗生素治疗等措施，由肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌以及流感嗜血杆菌等导致的细菌性肺炎仍是社区获得性肺炎的主要病因之一，而流感病毒感染引起的继发细菌性肺炎出现抗生素治疗有限、病情加重、预后差等特点，引起了广泛重视和研究。相关研究表明，流感病毒感染能通过多种途径抑制机体的先天性免疫应答，并为呼吸道正常定植细菌向肺部侵袭提供多种条件。本文就近年来流感病毒感染引起的继发细菌感染的易感机制进行综述。

1 流行病学研究

1.1 既往流行情况

流行性感冒（流感）继发细菌感染最早报告于18世纪初，随后法国内科医生René T. H. Laennec通过临床观察和一系列尸检研究证实流感的流行能显著增加人群细菌性肺炎的发病率[2]。在此之后大量研究表明，流感病毒可通过抗原变异和基因重组完成进化，导致新型病毒的出现甚至大流行。不同亚型的流感病毒感染均可增加细菌感染的易感性，在大流行期间尤为显著。

1918年H1N1流感大流行期间，全球约有一半人口被感染，患病人数高达5亿，死亡人数约有4 000万～5 000万。受当时科学技术所限，无法有效分离出致病原，但Morens等[3]对58例1918年流感死亡患者尸检进行重新鉴定，并回顾109篇8 398例尸检结果，证实绝大多数死亡病例合并细菌感染，以肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、化脓性链球菌及金黄色葡萄球菌的合并感染最为常见。Brundage[4]对同期美国军营回顾性研究发现，流感流行期间37个军营的平均发病率为23%（四分位间距15%～28%），16%的人进一步发展为肺炎（四分位间距10%～20%），并最终有34%肺炎患者死亡（四分位间距22%～41%）。肺炎病人痰培养结果显示：26%～65%的病人肺炎链球菌培养阳性，1.3%～50%金黄色葡萄球菌培养阳性，2.5%～22%流感嗜血杆菌培养阳性。此外，Brundage的研究还发现，1918年流感流行期间流感发病人数、肺炎发病人数以及相关死亡人数具有相似的流行趋势，但三者之间存在7～10 d的延迟。

与1918年流行不同，抗生素的发明和使用大大降低人群细菌性肺炎的发病率，肺炎链球菌病人的病死率也从30%降至5%，但仍有100万～400万人在1957年H2N2大流行期间死亡。除流感病毒表面糖基化位点增多导致致病力增强外，细菌的继发感染也是非常重要的原因，并且一些非典型肺炎病原体，如军团杆菌、衣原体、支原体同期检出率明显增高。Hers[5]对同期荷兰158例流感致死病例进行了调查，其中59%的尸检者肺部金黄色葡萄球菌阳性，15%肺部肺炎链球菌阳性。进入21世纪后，流感的流行和疫情进入了低发水平状态，相关疫苗接种以及医疗条件的提升使流感继发细菌感染的病例下降。但2009年新甲型流感爆发期间，一项研究发现838名流感病毒阳性患儿中274人临床确诊合并细菌性肺炎，其中183人细菌培养阳性[6]。Rice[7]对美国35个重症监护室的683名新甲型H1N1重症患者进行队列研究发现，207人在入院后的72 h出现细菌感染症状，平均起病时间为5.2 d（0.3～10.1 d）。154人细菌培养阳性，以金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌感染为主，并且31%的死亡率也明显高于无细菌继发感染的患者。

1.2 流行现状

由于流感能引起多种并发症，而且其他呼吸道病毒也能继发引起细菌性肺炎，目前尚无法精确获得流感合并细菌感染的流行情况，但据美国病毒监测系统估计1976—2009年平均每年有66 324人死于共感染（45 030～91 871人/年），以65岁以上老年人死亡率最高[8]。但另一项研究认为，只有0.5%的健康青年患者容易合并细菌感染，在老年人和患有慢性基础性疾病患者中这个比例也只有2.5%[9]，这可能与研究人群早期使用奥司他韦和扎那米韦等抗病毒药物有关。在发达国家，据估算约有22%的社区获得性肺炎患者是由流感感染引起，39%的患者则由细菌和其他病毒双重感染引起。在发展中国家，由于缺乏有效的监测系统和完善的医疗条件，流感合并细菌感染的造成的死亡率很难估算，一般认为要高于发达国家水平，在经济落后的地区可能为估计值的数倍至数十倍。

我国目前尚未有流感合并细菌感染的详细报道，但郑南红[10]对2009年72例新甲型流感重症确诊病例研究发现，22例患者中性粒细胞百分比升高，推测其合并细菌感染。邓华[11]对138例甲型流感患者的C反应蛋白的值进行检验，并估算出约20%～50%的甲型流感患者合并细菌感染。由于我国5岁以下儿童和65岁以上老年人口众多，对流感和细菌普遍易感，发生流感继发细菌性肺炎的风险较高，需积极采取应对和预防措施。

2 流感致细菌感染的易感机制

多种致病菌，如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、化脓链球菌等均是人上呼吸道正常定植菌群，在呼吸道黏膜免疫屏障作用下多数人呈无症状感染或携带。通过体外细胞实验和构建多种动物感染模型，发现流感病毒可通过多种途径和方式来削弱或抑制宿主的先天性免疫应答，增加细菌向下呼吸道侵袭的易感性并加快细菌性肺炎进展。

2.1 呼吸道物理性功能缺失

呼吸道纤毛摆动和黏液分泌构成呼吸道清除病原体的首道屏障。流感病毒在上呼吸道的复制能降低纤毛摆动频率，减缓呼吸道黏膜分泌液流动速率，进而导致上呼吸道物理性清除细菌能力大大下降，呼吸道分泌物在细支气管内的潴留也为细菌的侵袭提供良好的结合位点和营养环境。此外流感病毒能导致呼吸道小气管分泌释放纤维蛋白和黏蛋白，引起局部黏膜充血和水肿，并阻塞呼吸道。受感染的呼吸道黏膜发生变形、脱落和坏死，又进一步影响下呼吸道黏液和纤毛的功能，促进下呼吸道细菌繁殖[12]。此外，流感病毒还能破坏肺泡壁上皮细胞和毛细血管内皮细胞，导致肺泡间隔增厚并影响正常气体交换，肺生理功能的缺失进一步降低其清菌能力。

2.1. 细菌黏附受体的增加

流感病毒可通过表面蛋白——血凝素（hemagglutinin，HA）与呼吸道上皮细胞结合，在内吞作用下进入细胞并大量复制，在另一种表面蛋白——神经氨酸酶（neuraminidase，NA）作用下裂解细胞表面唾液酸，出芽并完成复制周期。在这个过程中，HA蛋白和NA蛋白能够改变受感染细胞的表面蛋白受体，为细菌的黏附提供结合位点；部分受感染的呼吸道纤毛细胞发生脱落和死亡，上皮细胞和基底细胞层功能受损并被破坏，导致多种细菌结合位点发生暴露。细菌通过表达多种毒力因子与基底细胞黏附位点或细胞外纤连蛋白结合，造成呼吸道细菌的大量繁殖。

此外，流感还通过其它3种机制增加细菌黏附受体：第1种，流感NA蛋白具有酶活性，除了裂解细胞表面唾液酸糖基部分增加细菌黏附受体外，还能破坏具有细菌诱饵受体功能的唾液酸黏蛋白。体外细胞实验发现将流感病毒与人类上皮细胞系A549共同孵育30 min后，细胞表面细菌黏附性明显增强；应用胰蛋白酶处理后，A549细胞表面蛋白明显减少，细菌黏附性也大大降低[13]。第2种，在流感免疫应答中，机体产生并上调包括血小板活化因子受体（Platelet activating factor receptor，PAF-R）在内的多种细菌黏附受体。Sluijs[14]研究证实，PAF-R的缺失虽然不影响小鼠肺内病毒的清除，但肺内细菌继发感染量大大降低，生存率也显著提高，表明PAF-R在细菌继发感染过重中起着重要的受体结合作用。第3种，呼吸道恢复期的愈合部位也能为细菌的黏附提供结合位点。损伤修复的细胞和处于不同分化状态的细胞可表达包括唾液酸多糖和α5β1整合素在内的多种顶端受体，处于上皮细胞愈合期的基底细胞膜能够表达层粘连蛋白和胶原蛋白，这些因素共同作用为细菌的侵袭和黏附提供了便利条件。

2.2免疫细胞功能失调

由肺泡巨噬细胞（AM）、中性粒细胞（PMN）、自然杀伤细胞（NK）和树突细胞（DCs）等免疫细胞构成了人体抵抗细菌侵袭的第二道防线，它们通过吞噬、趋化反应以及胞内杀伤等作用来清除病原体，并同时招募多种细胞因子和趋化因子来加强清除。

AM是肺内识别和应答侵袭性细菌的重要免疫细胞，流感病毒的初始感染通过多种途径干扰AM对细菌的识别和杀伤能力。Sun[15]在2008年研究发现，流感病毒感染小鼠5 d后AM的数量并没有发生变化，但荧光显微镜下可见其吞噬能力发生障碍，而此时抗病毒产生的干扰素γ（IFN-γ）含量相应增加。进一步研究发现IFN-γ通过下调巨噬细胞表面清道夫受体（alveolar macrophage scavenger receptor，MARCO）使AM抗菌能力下降，而使用IFN-γ特异性中和抗体能有效抑制小鼠肺内细菌含量。Chen[16]通过研究发现流感病毒对AM分化也有一定影响，流感应答产生的白介素4（IL-4）和IL-13可诱导选择性激活巨噬细胞（Alternatively activated macrophages，AAM）相关基因表达，分化形成的AAM杀菌能力大大降低，说明流感病毒引起的正常抗病毒免疫同时影响了AM的正常抗菌机制。此外，尚有研究发现流感病毒通过抑制AM对细菌Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）的识别来减少感染部位免疫细胞的招募，但其机制仍需进一步研究。

PMN是肺部清除细胞外细菌的另一种免疫细胞，流感病毒的复制也能抑制PMN功能。McNamee[17]研究发现小鼠流感感染3 d后肺炎链球菌并不易感，但6 d后易感性显著增加，12 h和24 h后的肺炎链球菌含量分别提高485.5和194.4倍；PMN缺失的小鼠反而在流感感染的第3天对肺炎链球菌易感，但6 d易感性无明显变化。进一步研究显示，流感病毒通过抑制PMN细菌吞噬能力和细胞内活性氧的产生来改变PMN正常生理功能。然而Karlstrom[18]研究发现，对共感染的小鼠使用抗生素治疗虽然能使继发感染的肺炎链球菌裂解，但大量PMN在小鼠肺部的浸润反而造成严重损伤，死亡率也明显抬升。另有一些研究也发现，流感感染后细菌的继发感染虽然能招募大量PMN，但PMN抗菌吞噬能力已大大降低，释放产生的大量炎症介质反而具有损伤器官作用。因此，PMN在继发感染过程中可能起着抗菌和损伤的双重作用，其具体作用机制仍需进一步研究。

NK细胞在病毒感染早期阶段通过杀伤受感染细胞和产生细胞因子来起到抗病毒作用，流感的感染也可抑制NK细胞的正常免疫应答，降低肿瘤坏死因子α（TNF-α）的产生，并间接抑制AM的抗菌能力[19]。尽管之前有研究认为NK细胞可通过上调IFN-γ和IL-10来增加肺炎链球菌继发感染的易感性，但在金黄色葡萄球菌和流感共感染的小鼠体内未观察到该现象，这很可能与流感后不同细菌具有不同的易感途径有关。

DCs在免疫应答程度过程中能够诱导效应T细胞和B细胞克隆与分化，并同时产生多种促炎细胞因子、趋化因子和I型干扰素。但目前研究对于DCs在先天性抗细菌和抗病毒免疫中的作用存在争论，仍需更多的研究来进一步确认。

2.3病原识别受体通路的改变

正常情况下，宿主免疫系统可通过识别病原体表面的模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）来介导免疫应答，TLRs途径是宿主识别流感和细菌的共同免疫通路。流感病毒主要激活宿主TLR3、TLR7、TLR9途径，而细菌则通过TLR2、TLR4、TLR5、TLR9等途径被宿主识别[2]。调节分子MyD88在TLRs作用下活化NF-κB通路或丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated kinase，MAPK）通路来招募和分泌多种细胞因子、趋化因子以及粘附分子来清除致病菌。在继发感染过程中，由于流感和细菌免疫激活通路和信号转导分子非常相似，因而有研究认为流感的初始感染能导致细菌PRRs持续性的脱敏，正常的细菌识别功能和免疫应答持续性抑制数周或数月，继而增加细菌继发感染的风险。

2.4 其它易感机制

近年来研究发现，流感病毒感染过程中激活产生的细胞因子和趋化因子是免疫过程中的重要中间递质，具有增加细菌粘附受体、激活或抑制免疫细胞功能，并可以上调或抑制相关免疫调节通路，成为研究的热点。动物实验已经证实流感病毒的初始感染会增加肺内TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子分泌，导致肺内PMN大量聚集、肺泡上皮细胞损伤以及肺部水肿，为细菌的继发感染提供侵袭环境。Li[20]研究发现，流感病毒NA蛋白能够活化免疫调节分子——转化生长因子β（Transforming growth factor β，TGF-β），激活Smad信号通路，继而上调细菌粘附附因子，使用TGF-β抑制剂能有效阻止A组链球菌的黏附。抑炎因子IL-10是细菌继发感染繁荣另一种重要调节因子，Sluijs[21]研究发现流感恢复期的小鼠IL-10含量是正常小鼠的的50倍，使用IL-10抗体显著降低小鼠肺内肺炎链球菌定植量，继发感染的致死率也大大降低。由于继发感染过程中多种免疫细胞主要通过细胞因子和趋化因子来互相调节、平衡，整个炎症反应呈现出复杂的交互作用，因而使用单个细胞因子抗体并不能完全阻止细菌继发感染的发生。Jamieson[22]实验结果也显示，TNF-α、caspase-1、MyD88、TLR2/4、Nos2基因缺失的小鼠在流感病毒和噬肺性军团杆菌共同感染下，生存率并没有显著提高，提示我们可能还存在其它的易感途径。

3 未来研究展望

在过去的数年中，新颖的流感病毒增加细菌性肺炎的易感机制不断出现。一些研究认为，流感的感染会造成抗原呈递细胞（Antigen presenting cell，APC）的脱敏，形成细菌继发感染的易感窗口期。另有一些研究发现，接种细菌疫苗并不能很好的降低流感后细菌性肺炎的发生[23]，接种流感疫苗反而显著降低儿童急性中耳炎发病率，并降低老年人肺炎入院率、侵袭性肺炎感染以及死亡率[24]。这些结果表明有效的切断流感病毒对免疫系统的影响，依然是治疗和控制继发细菌性肺炎的重要手段。然而遗憾的是，迄今为止针流感对免疫调节方面的作用并没有得到统一的结论，造成该结果的可能原因有：① 流感病毒类型、感染剂量以及细菌类型均会影响宿主的免疫应答，仍需收集不同的实验条件下的不同研究结论。② 流感感染过程中的免疫调节是多因素共同作用的，抑制单个因素无法完全控制细菌性肺炎的发生。③ 免疫过程是一个复制的动态变化过程，相关免疫细胞作用和免疫通路仍需进一步研究。

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【作者简介】史庆丰（1986—），男，博士 （收稿日期：2016-04-07）

[通讯作者] 蒋露芳，Email：jianglufang@fudan.edu.cn