神经突起生长因子蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

童莹，张峤，单莉

（新疆医科大学附属肿瘤医院肺内一病区，新疆省乌鲁木齐市830011）

临床论著

神经突起生长因子蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

童莹，张峤，单莉

（新疆医科大学附属肿瘤医院肺内一病区，新疆省乌鲁木齐市830011）

目的探讨Neuritin蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及其与临床病理特征和预后的相关性。方法收集在该院行手术切除的87例NSCLC组织及其对应的87例癌旁组织，采用免疫组织化学法检测癌及癌旁组织中神经突起生长因子（Neuritin）蛋白的表达，并根据二级计分法将其分为低表达和高表达部分，分析Neuritin蛋白表达水平与临床病理参数[病理类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结有无转移、表皮生长因子受体（EGFR）表达等]的相关性。结果Neuritin蛋白的阳性表达位于细胞质，NSCLC组织中Neuritin蛋白以高表达为主，其表达率为75.86％（66/87），远高于癌旁组织的31.03％（27/87），差异有统计学意义（P＜0.05）；且NSCLC组织中Neuritin蛋白表达水平与NSCLC病理类型、分化程度、肿瘤大小、EGFR基因突变相关（P＜0.05），与年龄、性别、吸烟与否、肿瘤部位、有无淋巴结转移无关（P＞0.05）；Neuritin高表达组的中位疾病无进展生存期（PFS）为16个月，低表达组的PFS为13个月，差异无统计学意义（P＞0.05）；随访数据中Neuritin高表达组的中位总生存期为37个月，低表达组为47个月，差异无统计学意义（P＞0.05）；结论Neuritin蛋白在NSCLC及其癌旁组织中均有表达，其中在NSCLC组织中呈高表达，且与NSCLC病理类型、分化程度、肿瘤大小、EGFR基因突变相关，提示Neuritin可能在NSCLC的发生、发展中发挥一定作用。

神经突起蛋白；非小细胞肺癌；免疫组织化学法

目前肺癌发病率居世界癌症首位，20世纪以来，由于环境恶化、职业暴露和吸烟人口的上升，肺癌的发病率和死亡率也急剧的上升，其中有75％～80％患者为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[1]，其5年生存率较低，＞90％患者死于浸润转移和复发，某些基因的异常表达是导致NSCLC不良预后的重要原因[2]。近年来，NSCLC的治疗及其进展是研究热点之一。神经突起生长因子（Neuritin）是一种与神经系统可塑性相关的神经营养因子[3]，既往多项研究显示，Neuritin高表达于多种肿瘤组织中，其过表达对肿瘤血管的生长有促进作用[4]，是一种潜在可能的促肿瘤生长因子。但Neuritin蛋白在实际肺癌组织中的表达情况及其与临床病理资料的关系目前尚不明确。因此本实验在前期研究的基础上，检测Neuritin蛋白在NSCLC及其癌旁组织中的表达，并通过收集一般资料及随访生存情况，探讨其与临床病理参数和预后的相关性，为后续机制学研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年8月-2014年2月在新疆医科大学附属肿瘤医院经病理确诊的87例NSCLC患者，取经手术切除的87例癌组织石蜡标本及其87例对应癌旁组织，标本均按照术后外科病理分期收集。其中，男性54例，女性33例；年龄40～75岁，中位年龄62岁；病理类型：腺癌54例，鳞癌33例；分化程度：低分化24例，中分化33例，30例分化程度不明；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期21例，Ⅲ期42例，Ⅳ期6例；肿瘤部位：周围型69例，中央型18例；肿瘤大小：≤3 cm者15例，＞3 cm者72例；45例有吸烟史，51例有淋巴结转移；行表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因检测者60例，其中21例突变型，39例野生型。主要试剂：兔抗人Neuritin抗体购于美国Prosci公司，第二抗体购于为北京中衫金桥公司（pv-6000）。

1.2 免疫组织化学法染色

切片开始前将组织蜡块置于冰冻切片机内复温30 min，修整组织使组织面最大程度暴露，按照5μm厚度进行连续切片，采用Envision两步法：切片脱蜡至水，95℃加热15 min以修复抗原，双氧水H2O2孵育10 min以减少背景染色。4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）振洗3次，5 min/次；滴加第二抗体，37℃孵育30 min；PBS振洗3次，5 min/次。二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色后进行苏木素核复染、脱水、透明、封片、干燥。每次实验均以PBS代替第一抗体作为阴性对照。

1.3 免疫组织化学法结果评判标准

均由两位病理医生采用双盲法阅片，Neuritin阳性染色定位于胞浆，采用阳性细胞计数与染色强度相结合的二级计分法。染色强度分类（按切片中细胞显色有无及深浅评分）：0分细胞无着色；1分显色为浅黄色；2分为深黄色；3分为棕褐色。取10个高倍镜视野中每100个细胞中阳性细胞所占百分比的平均值为阳性细胞计数，1分：显色细胞占切片中细胞总数的1/3以下；2分：1/3～2/3细胞显色；3分：2/3以上细胞显色。将两组评分相乘，按积分高低分为：＜1分：阴性（-）；2～4分：阳性（+）；＞5分：强阳性（++）。

1.4 评价指标

分析NSCLC组织及对应癌旁组织中Neuritin蛋白表达情况，并分析其与临床病理参数（性别、年龄、吸烟与否、肿瘤部位、病理类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结有无转移、EGFR表达）的相关性。

1.5 随访

采用电话、门诊复诊等手段对患者进行随访，截止时间为2015年10月31日，87例NSCLC患者失访6例，随访率为93.10％。疾病无进展生存期（progression free survival，PFS）的定义为自手术或治疗当日至患者出现疾病进展或死亡的时间。总生存期（overall survival，OS）的定义为自手术或治疗当日至患者死亡的时间。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计数资料以率表示，用χ2检验，采用Person相关检验分析Neuritin与临床病理参数间的相关性，Kaplan-Meier法进行生存分析并行Log-rank比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Neuritin蛋白在NCSLC组织及其癌旁组织中的表达

Neuritin表达的阳性部位均位于胞浆，着色为黄色、棕黄色或棕褐色；且NSCLC组织中Neuritin以高表达为主，本实验87例NSCLC组织中有66例表达呈强阳性，21例为弱阳性，其高表达率为75.86％，远高于癌旁组织的31.03％（27/87），差异有统计学意义（χ2=35.133，P=0.000）。见图1。

2.2 Neuritin蛋白的阳性表达率与非小细胞肺癌患者临床病理参数的相关性

NSCLC组织中Neuritin蛋白表达水平与年龄、性别、吸烟与否、肿瘤部位、有无淋巴结转移无关（P＞0.05），与NSCLC病理类型、分化程度、肿瘤大小、EGFR基因突变相关（P＜0.05）；其中病理类型鳞癌的高表达率高于腺癌（90.91％vs 66.67％）；分化程度中低分化者高表达率高于中分化者（87.50％vs 63.64％）；肿瘤直径＞3 cm者的高表达率高于肿瘤直径≤3 cm者（40.00％vs 83.33％）；EGFR基因野生型者的高表达率高于EGFR基因突变型者（92.31％ vs 71.43％）。见附表。

2.3 Neuritin蛋白的阳性表达率与预后的关系

图1 Neuritin在NSCLC组织及其癌旁正常组织中的表达（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法×40）

附表NSCLC临床病理参数与Neuritin蛋白表达水平的关系例

全组随访18～49个月，中位随访时间27个月。全组失访6例，随访率为93.10％；另有3例因术后感染等严重并发症死亡出组，84例NSCLC随访数据中有51例疾病进展，33例无疾病进展，21例死亡，57例至随访结束仍然存活。①Neuritin高表达组的中位疾病PFS为16个月，95％CI为（4.791，27.209），低表达组的PFS为13个月，95％CI为（7.019，18.981），差异无统计学意义（P=0.086）；②Neuritin高表达组的中位OS为37个月，低表达组的为47个月，差异无统计学意义（P=0.092）。见图2、3。

图3 Neuritin表达水平的总生存曲线分析

3 讨论

Neuritin是一种与长期可塑性相关的脑源性神经营养因子，最早由NEDIVI等[5]从大鼠海马齿状回中分离得到的，又称cpg15。以往研究多集中于神经系统中，其表达产物参与神经发育的多个过程[3，6]，也是中枢神经系统疾病治疗的一个潜在靶点[7]。而RAGGO等[8]在卡波氏肉瘤的研究中，首次发现裸鼠体内注射稳定表达Neuritin的细胞一段时间后，在相应部位有肿瘤形成，且Neuritin过表达的肿瘤体积较对照组明显增大，是卡波氏肉瘤发生一个重要环节。近年来国内外不断有研究发现，Neuritin不仅表达于肺、肝等一些血供丰富的正常组织中，同时也高表达于多种肿瘤如肺癌、胃癌、肾母细胞瘤、结肠癌等组织中，且其过表达对肿瘤血管尖端细胞、血管内皮细胞的生长有促进作用，而肿瘤细胞失去控制的异常增殖需依赖新生血管网的形成，为其提供充分的血供及营养，这提示Neuritin是一种潜在的可能促进肿瘤血管生长因子[9-12]。陈友林[13]发现，Neuritin在脑胶质瘤中的表达强度与胶质瘤的病理分级、恶性程度呈正相关。曹健等[14]发现，Neuritin在乳腺癌组织中Neuritin的阳性表达率与乳腺癌淋巴结转移、TNM分期及ER/PR/HER2高阳性率有关，提示Neuritin在恶性肿瘤的发生、发展中发挥一定作用。

本研究初步发现，Neuritin在NSCLC及其癌旁组织中均有表达，其表达部位均位于胞浆。显微镜下大部分癌旁组织切片中Neuritin着色为黄色或淡黄色，着色细胞比例为30％～60％，而NSCLC组织切片中Neuritin着色为棕黄色或棕褐色，着色细胞比例多＞60％，提示Neuritin在NSCLC组织中存在高表达，而在癌旁组织为低表达。Neuritin在多种恶性肿瘤组织中存在高表达，提示Neuritin本身可能作为一种肿瘤相关生长因子在肿瘤的发生、发展中发挥一定作用。本研究相关性分析显示，NSCLC组织中Neuritin蛋白表达水平与年龄、性别、吸烟与否、肿瘤部位、有无淋巴结转移无关，但与NSCLC病理类型、分化程度、肿瘤大小、EGFR基因突变相关。其中在鳞癌中的表达高于腺癌，在低分化NSCLC中表达高于中分化者，在肿瘤直径＞3 cm的NSCLC中表达高于肿瘤直径≥3 cm者，在EGFR基因野生型中表达高于EGFR基因突变型。该结果与陈友林[13]、曹健等[14]的在乳腺癌、脑胶质瘤等肿瘤中表达趋势一致。对于恶性肿瘤，其与供养血管关系密切，肿瘤分化程度越低、体积越大者，供养血管越丰富，微血管密度越高。也有体外实验证实Neuritin在人非小细胞肺癌血管内皮细胞株中表达明显高于肺微血管内皮细胞株[15]，提示Neuritin可能作为一种潜在的促肿瘤血管生长因子在NSCLC的发展中发挥一定作用。而Neuritin与EGFR基因关系的具体机制尚不明确，两者可能有共同的相关传导通路，有待进一步明确。

另外本研究预后分析显示，从Neuritin不同表达水平的中位PFS和OS生存曲线图可见，两条曲线差异无统计学意义。由于本研究受标本数量、随访时间的限制，删失数据偏多，以及影响OS的因素众多，需后续进一步增加样本量及延长随访时间加以证实。

综上所述，本研究初步显示，Neuritin蛋白在NSCLC组织与癌旁正常组织中的表达水平比较，差异有统计学意义。NSCLC组织中Neuritin存在高表达，并且与NSCLC病理类型、分化程度、肿瘤大小、EGFR基因突变相关。后续进一步探讨NSCLC与Neuritin的相互关系，将有助于对NSCLC的认识，进而为肿瘤基因治疗提供新的靶点和理论依据。

综上所述，Neuritin蛋白在NSCLC组织中存在高表达，且与NSCLC的病理类型、分化程度、肿瘤大小及EGFR基因突变相关，提示Neuritin蛋白可能在NSCLC的发生、发展中发挥一定作用，可能成为肺癌预防和治疗的一个新靶点。但Neuritin蛋白在肿瘤组织中的具体作用机制还需大量临床随机、多中心的相关研究。

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（童颖丹 编辑）

Expression and clinical significance of neuritin protein in non-small cell lung carcinoma

Ying Tong,Qiao Zhang,Li Shan
(The First Department Of Lung Cancer,Tumor Hospital Affiliated To Xinjiang Medical Univercity,Urumq,Xinjiang 830011,China)

ObjectiveTo investigate the expression status of neuritin protein and its association with clinical pathological features and prognosis in non-small cell lung carcinoma(NSCLC).MethodsNSCLC tissues and the corresponding para-cancerous tissues were collected from 87 cases in our hospital.SP immunohistochemistry was used to detect neuritin expression in both NSCLC and para-cancerous tissues.The neuritin expression level was divided into low expression and high expression according to the two-grade scoring method. The relationships between neuritin expression level and clinical pathological parameters(pathological type, differentiation,tumor size,lymph node metastasis and EGFR gene)were analyzed.ResultsThe positive particles of neuritin were located in the cytoplasm.The positive rate of neuritin in the NSCLC tissues(75.86％, 66/87)was significantly higher than that in the para-cancerous tissues(31.03％,27/87;P＜0.05).Neuritin expression in the NSCLC tissues was correlated with pathological type,differentiation,tumor size andEGFR gene mutation(P＜0.05);and had no relationship with gender,age,smoking history,tumor location or lymph node metastasis(P＞0.05).The median progression free survival(PFS)had no statistical significance betweenthe high-expression(16 months)and low-expression(13 months)groups(P＞0.05).The median overall survival(OS)was 37 months in the neuritin high-expression group and 47 months in the neuritin low-expression group without significant difference(P＞0.05).ConclusionsNeuritin protein is expressed in both NSCLC and para-carcinoma tissues,but highly expressed in NSCLC tissues.Neuritin expression is correlated with pathological type,differentiation,tumor size andEGFRgene mutation in NSCLC.It may play an important role in the occurrence and development of NSCLC.

neuritin;non-small cell lung carcinoma;immunohistochemistry

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.015

1005-8982（2017）01-0077-05

2015-12-28

单莉，E-mail：84972673@qq.com