塞来昔布抑制非小细胞肺癌肿瘤增殖及血管生成效果的实验研究

张俊玲+王培毅+续飞+魏燕+任滨+王军

[摘要]目的探讨塞来昔布抑制非小细胞肺癌肿瘤增殖及血管生成的效果。方法48只裸鼠建立非小细胞肺癌模型后，分为两组，均使用含有塞来昔布的饲料喂养，观察组则联合使用浓度为100μmol/L的塞来昔布治疗，持续120d后，比较两组细胞增殖情况及血管内皮生长因子水平和微血管密度。结果观察组72h抑瘤率高于对照组（P<0.05），细胞凋亡染色率（TUNEL法）高于对照组（P<0.05），血管内皮生长因子整体水平低于对照组（P<0.05），微血管密度低于对照组。结论对非小细胞肺癌大鼠，使用100μmol/L塞来昔布治疗能较好的抑制肺癌肿瘤细胞的增殖以及新生血管的形成，且随着时间的延长，抑瘤率提高。

[关键词]塞来昔布；非小细胞肺癌；肿瘤增殖；血管生成；实验研究

以往研究已经证实，COX-2的表达与多种实体恶性肿瘤存在相关性，针对非小细胞肺癌患者，其同样呈现阳性表达，而且COX-2的高表达性，预示着肿瘤细胞具有较强的侵袭性以及早期的淋巴转移倾向。其机制包括：促使肿瘤细胞的增殖抑制凋亡、促进肿瘤组织新生血管的形成同时抑制机体免疫反应等。目前多数学者认为非甾体抗炎药物可在体内及体外均起到抑制人非小细胞肺癌的增殖的作用，尤其是塞来昔布治疗后，一般于4周左右，肺癌肿块出现明显缩小，其发生转移时间延长，几率降低。鉴于目前对于使用非甾体抗炎药物辅助治疗非小细胞肺癌尚无推荐剂量。本研究主要通过比较新型非甾体抗炎药物一塞来昔布对肿瘤细胞增殖及对血管生成的影响，探讨其治疗非小细胞肺癌的临床效果，现报道如下。

1资料与方法

1.1材料及试剂来源

所选人肺腺癌A549细胞株购置于上海微生物细胞研究所。所选塞来昔布由安徽合肥森瑞化工有限责任公司生产，Annexin V-FITC凋亡试剂盒由美国PharMingen公司提供，噻唑蓝试剂由华美生物材料公司生产，DMEM培养基由美国GIBCO公司提供，细胞原位凋亡检测试剂盒由美国瑞驰生物公司提供。二氧化碳孵育箱由美国NAPCOInternational Corporatio提供，倒置型电子显微镜由日本奥利巴斯公司提供，Epicsrxl型四色流式细胞仪由美国贝克曼库尔特公司提供，Mr5000型全自动酶标仪由美国Dynatech公司提供。

1.2细胞培养及建模

细胞培养首先将人肺腺癌A549细胞置于13%灭活小牛血清DMEM培养基内，于37℃5%二氧化碳及40%湿度条件恒温箱内，保持培养基内青霉素和链霉素浓度控制在100U/mL。裸鼠建模：将含有2×10⁶细胞数的细胞悬液200μL分别注入6周龄裸鼠右前肢腋下，并将人组48只裸鼠进行随机分为两组，每组各24只，并于接种肿瘤细胞后第2天开始服用药物，均使用含有塞来昔布1250mg/kg的饲料喂养，连续喂养120d，喂养期间对裸鼠精神食欲及排便情况进行观察并记录，每周对裸鼠体重及肿瘤大小进行监测。肿瘤体积计算（单位：mm3）=短径²x长径/2，120d后使用空气注射法处死裸鼠，对肿瘤结节称重并测量其体积。

1.3塞来昔布对A549细胞增殖作用的影响

观察组将对数生长期人肺腺癌A549细胞5x10³个/孔接种至96孔培养板内，分别于24h及72h后，观察组塞来昔布浓度为100μmol/L，加入助溶剂DMSO 5mL，对照组使用相同剂量的生理盐水，培养液含有助溶剂DMSO 5mL，37℃40%湿度条件恒温箱内培养4h，去除培养液后加入150μL助溶剂。使用全自动酶标检测仪测定A 549nm值，计算两组细胞生长抑制率（对照组A 549nm-观察组A549nm）/对照组A 549nm]x100%。通过肿瘤结节重量计算抑瘤率：[1-（观察组肿瘤结节质量/对照组肿瘤结节质量）1x100%。采用TUNEL法测定肿瘤细胞凋亡情况，并使用400倍高倍镜观察。

1.4两组血管内皮生长因子水平及微血管密度检测

均采用免疫组化实验SP法进行，通过石蜡包埋并制备成厚4μm石蜡切片。分别进行常规HE染色和光镜检查，以及脱蜡与水化处理，血管内皮生长因子中免疫组化阳性为棕黄色，测定并计算平均吸光度。微血管密度计数采用Tanaka法进行，将肿瘤区内染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇视为1个血管计数，由低倍镜下确定5个高血管密度区，并确定为1个“热点”，于高倍镜下计算被染成黄色微血管平均数。

1.5统计学处理

应用SPSS13.0进行统计学处理，计量资料以（x±s）表示，两组间均数的比较使用t检验，组间率的比较采用x²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组24h及72h抑瘤率比较

对照组24h抑瘤率为（7.20±2.58）%，72h抑瘤率为（11.35±3.74）%，观察组24h抑瘤率为（34.15±12.41）%，72h抑瘤率为（65.31±15.38）%，观察组24h及72h抑瘤率显著高于对照组（P<0.05）。见图1。

2.2两组细胞生长抑制率比较

观察组细胞生长抑制率为（931±4.85）%，对照组细胞生长抑制率为（2.59±1.18）%，观察组细胞生长抑制率高于对照组（P<0.05）。见图2，表1。

2.3两组微血管密度比较

观察组微血管密度为（17.5±5.6）个/m㎡，对照组为（36.6±13.9）个/m㎡，观察组细胞生长抑制率低于对照组（P<0.05）。见图3，表1。

3讨论

环氧化酶主要是催化前列腺素类因子生成的限速酶，其包括COX-1与COX-2两种形式。大量研究提示，COX-2的过度表达是恶性肿瘤发生发展的相关因素。对肺癌患者的检测发现，非小细胞肺癌的腺癌患者中的COX-2表达最为强烈，而小细胞肺癌患者则几乎未见COX-2的过度表达。提示在非小细胞肺癌，尤其是腺癌患者使用COX-2抑制剂，可能取得较好的临床效果。

本研究结果提示，观察组24h抑瘤率为（34.15±12.41）%，72h抑瘤率为（65.31±15.38）%，观察组24h及72h抑瘤率显著高于对照组，见图1。可能是因为使用含有塞来昔布饲料喂养的结果，但其效果远不及观察组，分别于37℃培养基下培养24h和72h，发生两组在24h的抑瘤率低于72h，且有效浓度者抑瘤率高于低浓度者。故可以认为，塞来昔布对肺癌细胞增殖抑制效果，在药物安全范围内，随着药物浓度增高而增强。在使用有效浓度的塞来昔布治疗后，达到了抑制肺癌细胞增值的有效浓度，促使肺癌细胞阻滞在C0/G1期，通过TUNEL法检测后发现观察组细胞生长抑制率为（9.31±4.85）%，对照组细胞生长抑制率为（2.59±1.18）%，见图2。提示观察组其TUNEL法细胞凋亡染色率显著高于对照组。出现以上结果可能的原因是，有效浓度塞来昔布治疗将肺癌细胞增值阻滞于细胞周期的GO/G1期，同时更好的诱导肿瘤细胞凋亡。同时针对两组微血管密度比较发现，观察组微血管密度为（17.5±5.6）个/m㎡，对照组为（36.6±13.9）个/m㎡，观察组细胞生长抑制率低于对照组，见图3。可考虑与塞来昔布对肺癌细胞的抑制效果呈时间相关性有关，药物使用时间越长，其抑瘤率提高。其原因可能是，塞来昔布使用后将影响肿瘤细胞生长周期，延缓肺癌细胞的快速增殖，促使其凋亡。而且使用塞来昔布后，有效的抑制了COX-2的过度表达，从而抑制了肺癌细胞的增殖，促使肺癌细胞凋亡。且COX-2的抑制后，体内基质金属蛋白酶表达水平降低，肿瘤细胞的细胞外基质被降解，肿瘤相关的血管生长因子表达显著降低从而引起促进肺癌组织血管形成、侵袭与转移的活性降低，故使用塞来昔布后其微血管密度显著降低。

综上所述，对非小细胞肺癌大鼠，使用100μmol/L的塞来昔布治疗，能较好的抑制肺癌肿瘤细胞的增殖以及新生血管的形成，且随着时间的延长，能更好的提高其抑瘤率。