卵裂期冻融复苏胚胎进一步发育情况对临床结局的影响

惠董娜，任文娟，雷鑫，刘建荣，王怀秀，李弘

(山西省人民医院生殖医学科，太原 030012)

卵裂期冻融复苏胚胎进一步发育情况对临床结局的影响

惠董娜，任文娟，雷鑫，刘建荣，王怀秀，李弘*

(山西省人民医院生殖医学科，太原 030012)

目的 探讨卵裂期冻融复苏胚胎过夜培养后胚胎生长个数及卵裂球增殖情况对临床结局的影响。 方法 回顾性分析我中心268个卵裂期FET周期，根据过夜培养后复苏胚胎的生长个数分为0个生长组(A1，n=46)、1个生长组(A2，n=48)和2个及以上生长组(A3，n=174)；根据卵裂球增殖情况分为<8细胞组(B1，n=39)、8～16细胞组(B2，n=57)和含融合细胞组(B3，n=126)；比较各组间的种植率、妊娠率和多胎率。 结果 A3组妊娠率、种植率(分别为55.17%、34.29%)显著高于A1组(分别为15.22%、6.67%)、A2组(分别为29.17%、16.00%)(P<0.01)，且A2组妊娠率、种植率显著高于A1组(P<0.01)，A3组多胎率显著高于A2组(36.46% vs.7.14%)(P<0.01)，A1组无多胎妊娠；B2组妊娠率显著高于B1组(52.63% vs.27.59%)(P<0.01)，B2组种植率显著高于B1组(31.15% vs.10.71%)(P<0.05)，而B2组与B3组妊娠率、种植率均无显著差异(P>0.05)，三组间多胎率无显著差异(P>0.05)，但B3组多胎率有所升高。 结论 卵裂期冻融胚胎经过夜培养后，有2个及以上生长的胚胎，且卵裂球发育到8～16细胞或有融合细胞阶段者，能获得更好的临床结局；对移植含2个及以上生长的胚胎，可考虑选择单胚胎移植，以降低多胎妊娠长方案及拮抗剂方案中HCG日孕酮水平对IVF-ET妊娠结局的影响。

卵裂期胚胎； 冻胚移植； 过夜培养； 种植率； 临床妊娠率； 多胎率

(JReprodMed2017，26(1)：19-23)

冻融胚胎移植(FET)作为辅助生殖中一项重要的衍生技术，可避免卵巢过度刺激综合征(OHSS)，使患者一次促排卵周期形成的胚胎实现最大限度的利用，有效地提高了临床累积妊娠率[1]。FET能否取得较好的临床结局与解冻复苏后的胚胎质量密切相关[2-3]。通过观察过夜培养后胚胎进一步发育情况评估胚胎质量，为选择具有高种植潜力和发育潜能的胚胎提供了一个重要指标[4]，并以此达到改善临床结局的目的。本文回顾性分析我中心268个FET周期，依据冻融复苏后移植胚胎生长个数以及卵裂球增殖情况探讨胚胎质量对FET临床结局的影响。

资料与方法

一、临床资料

收集2013年6月至2014年12月在本院生殖医学科行全胚冷冻或新鲜周期移植失败的患者234例，268个周期。女方年龄21～48岁，不孕年限1～20年。

纳入标准：卵裂期冻融胚胎移植周期；女方因盆腔输卵管、排卵障碍等因素不孕，男方少、弱、畸精、无精症等因素不育，以及免疫因素、原因不明致不孕；内膜准备方案均为人工周期。

排除标准：移植单个卵裂期胚胎；女方子宫内膜异位症、宫腔粘连等影响着床的因素。

二、方法

1.冷冻胚胎的选择：胚胎质量评分按我科标准进行评级：Ⅰ级≥8细胞，卵裂球大小均匀，碎片<5%，无空泡，无多核；Ⅱ级≥7细胞，卵裂球大小均匀或大致均匀，碎片10%～20%，无空泡，无多核；Ⅲ级4～7细胞或≥8细胞，卵裂球大小不均匀，碎片≤20%，有少量空泡，无多核；Ⅳ级4～7细胞或≥8细胞，碎片>20%，卵裂球大小不均匀，有多核；Ⅴ级<4细胞或大量碎片，半数卵裂球为多核。D3选择Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎进行冷冻。

2.胚胎冻融、培养与移植：按上述标准冷冻保存D3胚胎。胚胎冷冻采用玻璃化法冷冻试剂盒(Kitazato，日本)，操作按说明书进行，每载杆放置2～3枚胚胎，置于最前端，快速放入液氮中保存；于移植前一天下午解冻，根据患者情况选择解冻胚胎的数量，一般2或3枚胚胎，采用玻璃化解冻试剂盒(Kitazato，日本)，具体操作按说明书进行；解冻后胚胎转入含人血清替代品的1026中(Quinn’s， SAGE，美国)，过夜培养17 h，第2天早上观察胚胎、评级并做辅助孵化，再行移植。解冻后未移植的胚胎，根据其质量决定继续冻存或废弃。

3.内膜准备：内膜准备方案均采用人工周期。月经周期第2～3天行阴道超声，根据患者既往内膜厚度决定戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳，德国)的起始用量及持续用量，待子宫内膜≥8 mm并出现三线征时，加用黄体酮并诱导内膜向分泌期转化，3 d后移植。

4.研究分组：(1)根据过夜培养后，胚胎复苏生长情况分为0个生长组(A1，n=46)、1个生长组(A2，n=48)、2个及以上生长组(A3，n=174)；(2)在胚胎生长组中，根据卵裂球生长情况分为≤8细胞组(B1，n=39)、8～16细胞组(B2，n=57)、含融合细胞(Compaction，CP)组(B3，n=126)。

5.随访及确定妊娠：移植后12～14 d检测血清ß-HCG，若血清ß-HCG>25 U/L提示妊娠，则继续黄体支持；若血清ß-HCG<0.5 U/L，则未妊娠，停止黄体支持。移植后30 d超声检查见孕囊、胚芽，移植后35 d超声检查心管搏动者确定为临床妊娠，继续黄体支持至妊娠10～12周。

三、统计学分析

结 果

一、患者一般资料

本研究共纳入268个卵裂期FET周期。共解冻胚胎632枚，存活胚胎599枚，胚胎存活率94.78%；移植胚胎587枚，种植154枚，种植率26.24%；妊娠117个周期，平均妊娠率43.66%，多胎妊娠36个周期，多胎妊娠率30.77%。

根据过夜培养后移植胚胎生长个数分为：0个生长组(A1)；1个生长组(A2)；2个及以上生长组(A3)。三组患者的年龄、不孕年限、原发不孕比率、ICSI比率以及移植日内膜厚度均无统计学差异(P>0.05)；2个及以上生长组(A3)全胚冷冻比例高于0个生长组(A1)及1个生长组(A2)，但无统计学差异(P>0.05)(表1)。

二、过夜培养后胚胎生长情况对临床结局的影响

过夜培养后，A1组46个周期，妊娠率15.22%，种植率6.67%，无多胎妊娠；A2组48个周期，妊娠率29.17%，种植率为16.00%，多胎率7.14%；A3组174个周期，妊娠率55.17%，种植率34.29%，多胎率36.46%。三组间解冻个数、移植个数及存活率无显著差异(P>0.05)。A3组妊娠率、种植率显著高于A1、A2组(P<0.01)，A2组妊娠率、种植率显著高于A1组(P<0.01)。A3组多胎率显著高于A2组(P<0.01)，A1组无多胎妊娠(表2)。

组别周期数年龄(岁)不孕年限(年)原发不孕比例A1463028±485341±24833/46(7174)A2482868±391382±31040/48(8333)A31742934±449370±314130/174(7471)组别周期数ICSI比例全胚冷冻比例移植日内膜厚度(cm)A1465/46(1087)20/46(4348)093±085A24813/48(2708)22/48(4583)094±090A317439/174(2241)101/174(5805)095±110

组别周期数解冻数(枚)移植数(枚)存活率A146231±047215±037108/113(9557)A248242±065214±035103/108(9537)A3174230±057219±041388/411(9440)组别周期数妊娠率种植率多胎率A1467/46(1522)∗#7/105(667)∗#0A24814/48(2917)∗16/100(1600)∗1/14(714)∗A317496/174(5517)131/382(3429)#35/96(3646)

注：与A3组比较，*P<0.01；与A2组比较，#P<0.01

三、卵裂球生长情况对临床结局的影响

过夜培养17 h后，根据卵裂球生长情况分组比较。B1组39个周期，妊娠率27.59%，种植率10.71%、多胎率11.11%；B2组57个周期，妊娠率52.63%，种植率31.15%、多胎率27.59%；B3组126个周期，妊娠率52.94%，种植率36.23%、多胎率37.50%。三组间解冻个数、移植个数及存活率无显著性差异(P>0.05)。B2、B3组种植率显著高于B1组 (P<0.01)；B2组妊娠率显著高于B1组(P<0.05)；B3组妊娠率显著高于B1组(P<0.01)。三组间多胎率比较无显著差异(P>0.05)，但B3组多胎妊娠率有所升高(表3)。

组别周期数解冻数(枚)移植数(枚)存活率B139231±047215±03786/91(9451)B257242±065214±035127/138(9203)B3126230±057219±041278/290(9586)组别周期数妊娠率种植率多胎率B1398/29(2759)∗#9/84(1071)∗Δ1/9(1111)B25730/57(5263)38/122(3115)8/29(2759)B312672/136(5294)100/276(3623)27/72(3750)

注：与B3组比较，*P<0.01；与B2组比较，#P<0.05，ΔP<0.01

讨 论

FET因其可避免卵巢过度刺激、减少再次促排卵操作等优点成为一些患者临床治疗的选择方案。有研究表明胚胎质量是影响FET临床结局的重要因素之一[2-3]。目前对FET周期中胚胎体外培养时间的选择多在解冻后2～4 h或是经过夜培养后，而是否要延长冻融胚胎的体外培养时间，各个中心的标准不同[5-8]，且对冻融胚胎体外培养时间和临床结局关系的认识也不同[6，8]。近来的一些研究显示，冻融复苏的胚胎经过夜培养，通过观察其是否恢复分裂并有增殖的细胞，可作为评价冻融复苏胚胎质量的一个指标，从而选择出具有高发育潜能的胚胎，以提高临床妊娠率[4，9-10]。

本研究所纳入的FET周期中解冻的胚胎经过夜培养后移植，根据移植时胚胎生长个数分为0个生长组、1个生长组、2个及以上生长组，各组间患者的年龄、不孕年限、原发不孕比例以及移植日内膜厚度等临床资料均无统计学差异，且内膜准备方案均采用人工周期，避免了其它影响FET临床结局的因素。结果显示，移植含2个及以上生长的胚胎组，其妊娠率和种植率显著高于0个生长组及1个生长组，差异具有统计学意义，且1个生长组的妊娠率及种植率显著高于0个生长组。说明复苏胚胎经过夜培养，能够恢复分裂生长的胚胎具有更好的发育潜能，可作为选择移植胚胎的一个关键指标，且移植含有2个及以上生长个数的胚胎能获得更好的临床结局。

解冻复苏的胚胎经过夜培养后进一步生长，具体表现为卵裂球数目的增加，即细胞的增殖。有研究表明复苏4 h已分裂的胚胎其临床妊娠率和单胚着床率都显著大于未分裂组[11]，而复苏后24 h未有卵裂球分裂生长的胚胎往往表现为染色体异常，仅有20%的胚胎为正常的二倍体[12]，说明复苏后胚胎能快速恢复有丝分裂是其具有良好发育潜能的一项重要指标。本研究中复苏后继续生长的8～16细胞组及含CP细胞组的妊娠率、种植率显著高于<8细胞组胚胎，而8～16细胞组和含CP细胞组的妊娠率及种植率无显著差别，提示复苏胚胎的卵裂球数目增加大于8细胞或已至融合阶段的会有更好的种植率及妊娠率，可能是由于8～16细胞或含CP的胚胎在随后发育中更容易形成囊胚，打破发育阻滞的情况，且发生细胞融合的胚胎促进了基因调控由母型调节向胚胎型调节的转化，对囊胚腔的形成、内细胞团及胚层分化发挥着积极作用，预示着较好的临床结局[13-14]。

多胎妊娠是辅助生殖技术中最为关注的问题之一，其所造成的妊娠高风险，以及对围产儿及新生儿健康等方面的影响， 成为辅助生殖领域亟待解决的问题。为降低多胎妊娠的风险，选择合适的单胚胎移植成为研究的焦点[15]。有研究表明，与多胎妊娠相关的因素包括年龄、获卵数、可利用胚胎数、移植胚胎数量、移植胚胎质量以及冷冻胚胎数[16]。本文对解冻后复苏胚胎质量与多胎妊娠的关系进行分析，结果显示含2个及以上生长胚胎组的多胎率显著高于0个生长组及1个生长组，差异显著有统计学意义，而0个生长组无多胎妊娠，提示过夜培养后，有2个及以上生长的胚胎需考虑选择单胚胎移植以降低多胎妊娠。同时，比较了有卵裂球增殖的胚胎，发现含CP组多胎率较高，但与<8细胞组及8～16细胞组比较并无显著差异，可能与样本量有关，仍需进一步研究。

综上所述，胚胎质量是影响卵裂期冻融胚胎移植临床结局的重要因素。复苏胚胎经过夜培养，能快速恢复有丝分裂并有增殖细胞者，预示有较好的发育潜能。移植中含有2个及以上生长的胚胎，且卵裂球数目在8～16细胞或含融合细胞的可获得更好的临床结局。对复苏后继续生长含有2个及以上生长的胚胎，可考虑选择单胚胎移植，并充分告知患者，以减少多胎妊娠的风险。

[1] 李媛.人类辅助生殖实验技术[M].第一版.北京：科学出版社，2008：139-140.

[2] Zdravka V， Mauri O， Sinikka NH， et al. Factors affecting the outcome of frozen-thawed embryo transfer[J]. Hum Reprod， 2013， 28： 2425-2431.

[3] 李荣，丘映，江莉，等.玻璃化冻融胚胎移植结局的相关因素分析[J].中国计划生育和妇产科，2015，7：31-34.

[4] 丁锦丽，杨菁，张艳，等.卵裂期胚胎冻融后发育速度可能作为胚胎植入潜能的评估参数[J].生殖医学杂志，2015，24：606-610.

[5] 罗金，杨菁，徐望明. 胚胎冻融后体外培养时间对妊娠结局的影响[J].生殖与避孕，2011，31：97-100.

[6] 骆荣，胡慧，洪焱，等. 玻璃化冻融胚胎提前解冻与当日解冻移植结局比较[J].生殖医学杂志，2015，24：17-20.

[7] 赵杰，陈秀娟，刘芳，等.冷冻胚胎解冻后质量对临床妊娠结局的影响[J].生殖医学杂志，2014，23：981-985.

[8] Sole M， Santalo J， Rodriguez I， et al. Correlation between embryological factors and pregnancy rate： development of an embryo score in a cryopreservation programme[J]. J Assist Reprod Genet，2011，28：129-136.

[9] 李荣，许常龙，谭秀群，等.冻融卵裂期胚胎移植中过夜培养对临床妊娠结局的影响[J].实用医院临床杂志，2015，12：55-57.

[10] 李伟，施文浩，李明昭，等.玻璃化冻融后胚胎卵裂球的损伤与生长融合对移植结局的影响[J].生殖医学杂志，2015，24：542-545.

[11] 孙贻娟，冯云，张爱军，等.冻融胚胎移植周期中胚胎因素的分析研究[J].生殖与避孕，2007，27：577-580.

[12] Laverge H， VanderElst J， DeSutter P， et al. Fluorescent in-situ hybridization on human embryos showing cleavage arrest after freezing and thawing[J].Hum Reprod， 1998，13：425-429.

[13] Blake DA，Farquhar CM. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted conception[J/DB].Cochrane Database Syst Rev，2007，17： CD002118.

[14] Iwata K， Yumoto K， Sugishima M，et al. Analysis of compaction initiation in human embryos by using time-lapse cinematography[J]. J Assist Reprod Genet， 2014， 31：421-426.

[15] Murray SR，Norman JE. Multiple pregnancies following assisted reproductive technologies-a happy consequence or double trouble? [J]. Semin Fetal Neonatal Med， 2014， 19：222-227.

[16] Hernandez-Nieto CA， Mendez-Lozano DH， Fraustro-Avila ME， et al. Analysis of factors associated with multiple pregnancies in assisted reproduction treatment complex[J].Ginecol Obstet Mex.， 2016， 84：27-30.

[编辑：谷炤]

Impact of further development of frozen-thawed embryo on clinical outcome

HUI Dong-na， REN Wen-Juan， LEI Xin， LIU Jian-rong，WANG Huai-xiu，LI Hong*

DepartmentofReproductiveMedicine，ShanxiProvincialPeople’sHospital，Taiyuan030012

Objective： To explore the impact of the number of grown embryos and the blastomere proliferation after overnight culture in frozen-thawed embryos at cleavage stage on the clinical outcome.Methods： A total of 268 frozen-thawed cycles were analyzed retrospectively. According to the number of grown embryos after overnight culture， the cycles were divided into three groups： no grown embryo group (A1，n=46)； one grown embryo group (A2，n=48) and more than two grown embryos group (A3，n=174). According to the proliferation of blastomere， the cycles were divided into three groups： blastomeres<8-cell group (B1，n=39)， blastomeres 8 to 16-cell group (B2，n=57) and blastomeres compacted group (B3，n=126). The implantation rate， pregnancy rate and the multiple pregnancy rate were compared among the groups.Results： The pregnancy rate (55.17%) and implantation rate (34.29%) in group A3 were significantly higher than those in group A1 (15.22%， 6.67% respectively) or group A2 (29.17%， 16.00% respectively) (P<0.01)， and those of group A2 were significantly higher than group A1 (P<0.01).The multiple pregnancy rate in group A3 were significantly higher than that in group A2 (36.46% vs.7.14%，P<0.01). There were no multiple pregnancy in group A1. The pregnancy rate (52.63% vs. 27.59%，P<0.01) and the implantation rate(31.15% vs.10.71%，P<0.05) in group B2 were significantly higher than those in group B1. The pregnancy rate and implantation rate between group B2 and B3 had no significant differences (P>0.05). There was no significant difference in multiple pregnancy rate among group B1， B2， and B3 (P>0.05)， but multiple pregnancy rate was slightly higher in group B3.Conclusions： Frozen-thawed embryos at cleavage stage after overnight culture， which had more than two grown embryos and blastomeres developed to 8 to 16-cell or compaction formed， can obtain better clinical outcomes. Single embryo transfer can be considered for patients who have more than two grown embryos after frozen-thawed to reduce multiple pregnancies.

Cleavage embryo； Frozen-thawed embryo transfer； Overnight culture； Implantation rate； Clinical pregnancy rate； Multiple pregnancy rates

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.004

2016-06-16；

2016-07-12

惠董娜，女，山西侯马人，硕士，检验技师.(*