Meta分析精子DNA完整性对辅助生殖结局的预测价值

谭艳，范立青

(1. 湖南省株洲市妇幼保健院生殖科，株洲 412000；2. 中南大学生殖与干细胞工程研究所，长沙 410078)

Meta分析精子DNA完整性对辅助生殖结局的预测价值

谭艳1，范立青2*

(1. 湖南省株洲市妇幼保健院生殖科，株洲 412000；2. 中南大学生殖与干细胞工程研究所，长沙 410078)

目的 系统评价精子DNA完整性对于宫腔内人工授精(IUI)、体外受精-胚胎移植(IVF-ET)以及卵胞浆内单精子注射(ICSI)等不同助孕方式妊娠结局的预测价值。 方法 采用电子检索和手工检索相结合的方式进行文献初检，检索Medline(via. OvidSP)、PubMed、Embase、CNKI、VIP等数据库，检索时限为建库至2016年3月，并手工检索相关会议资料。由2名评价者依据纳入与排除标准独立筛选研究文献、提取数据资料和评价方法学质量，然后采用RevMan 5.3软件进行Meta分析。 结果 最终纳入27篇队列研究，合计7 302个周期。Meta分析结果显示：DNA碎片指数(DFI)的增加会降低IUI临床妊娠率(RR=0.22，95%CI：0.12-0.41)、IVF受精率(RR=0.90，95%CI：0.86-0.95)、IVF优质胚胎率(RR=0.86，95%CI：0.82-0.91)、IVF临床妊娠率(RR=0.86，95%CI：0.76-0.98)，并增加IVF流产率(RR=1.65，95%CI：1.05-2.57)和ICSI流产率(RR=1.57，95%CI：1.03-2.39)(P均<0.05)；且DFI的检测方法中只有TUNEL法能预测IVF的临床妊娠率(RR=0.74，95%CI：0.55-0.99，P<0.05)，DFI对ICSI受精率、优质胚胎率、临床妊娠率的影响无统计学意义(P>0.05)。 结论 DFI水平高低对辅助生殖治疗的结局有一定的预测价值，DFI较高时选择ICSI的治疗方式可能更优于常规的IVF。但因纳入研究数量和质量的限制，上述结论还需开展更大规模流行病学研究和临床研究进一步验证。

精子； DNA完整性； 辅助生殖技术； Meta分析

(JReprodMed2017，26(1)：39-47)

精子DNA作为男性遗传物质的载体，其主要任务即完整地将遗传物质传递给子代。由于精子自身没有修复机制，因此DNA损伤几乎存在于所有精子中，精子DNA损伤程度对于生殖结局是否存在不利影响是临床关注的重点问题。有研究报道，在辅助生殖技术(ART)开展过程中，DNA损伤的精子会导致受精失败、胚胎发育障碍、活产率降低、出生缺陷以及后代的高发病率[1]，选择DNA完整的精子可以改善ART的治疗结果。评价精子DNA完整性的主要指标即精子DNA碎片指数(DFI)，其能否预测ART结局，一直存在很大争议。因此本研究采用Meta分析的方法评价DFI与ART主要结局的相关性，希望为临床上ART方式的选择提供更可靠的循证医学证据。

资料与方法

一、文献纳入与排除标准

纳入标准：研究类型为队列研究(cohort)，限中、英文；研究对象为确诊需通过ART助孕的正常卵巢储备功能者；以DFI为参数，研究高低水平DFI与受精率、优质胚胎率、临床妊娠率及流产率的相关性。

排除标准：纳入研究的类型不符、资料不全或无法提取原始数据的研究；失访人数>20%的研究。

二、检索策略

采用电子检索和手工检索的方式进行文献初筛，检索Medline(via. OvidSP)、PubMed、Embase、The Cochrane Library、CENTRAL，以及中国知网(CNKI)、万方数据库(WanFang Data)、维普信息资源系统(VIP)、读秀、中国生物文献医学数据库(CBM)，检索时限为建库至2016年3月，并手工检索相关会议资料，同时追溯纳入文献的参考文献。

中文检索词包括：精子DNA碎片、精子DNA完整性、辅助生殖技术、宫腔内人工授精、体外受精-胚胎移植、卵胞浆内单精子显微注射技术等。英文检索词包括：sperm DNA fragmentation、sperm DNA damage、DNA fragmentation index、DFI、in-vitro fertilization、IVF、Intracytoplasmic sperm injection、ICSI、IVF-ET、ART、AIH、IUI等，以及这些检索词的自由组合检索。该检索限中文和英文。

三、文献筛选、资料提取与质量评价

由两位研究员独立进行文献检索，排除不符合纳入标准的文献，当双方意见不一致时，参考第三方评价意见。

自制信息提取表，其中包括3个方面内容：(1)基本信息：包括题目、发表日期、作者姓名等；(2)纳入文献的资料：包括研究类型、研究人群、干预措施、结局指标等；(3)纳入文献的特征：包括研究方法、对象特征、数据结果。如文章相关资料缺失，则与作者联系寻求完整的临床数据。质量评价利用纽卡斯尔-渥太华量表(NOS)做为队列研究的偏倚风险评估工具[2]，NOS满分为9颗星(1颗星代表1分)，分数越高，文献质量越好。

四、统计分析

釆用Cochrane协作网的RevMan 5.3软件进行Meta分析，对提取的数据进行定量统计，合并后绘制森林图。采用χ2检验分析各文献结果间的异质性，检验水准设为α=1，结合I2判断异质性大小。若P>0.05且I2<50%，提示各研究结果间同质性较好，采用固定效应模型进行Meta分析；若P≤0.05和/或I2≥50%，提示各研究结果间存在统计学差异，根据DFI检测方式的不同采用随机效应模型进行Meta亚组分析。偏倚情况绘制漏斗图进行评估。

结 果

一、文献检索结果

通过数据库检索初检获得相关文献6 815篇，其中PubMed(n=569)、Medline(n=2 686)、Embase(n=1 190)、CENTRAL(n=465)、The Cochrane Library(n=10)、CNKI(n=405)、VIP(n=264)、万方数据库(n=793)、读秀(n=268)、CBM(n=165)，经评估、筛选后最终纳入文献27篇(共7 302个周期)，具体筛选流程和结果见图1，所纳入文献的基本信息见表1。纳入文献的质量评价得分在6～9分之间，文献质量较高。

(3)因此当生物炭添加量为2%时，pH值和容重最小，电导、饱和含水量和田间持水量均为最大，这对降低南疆沙化土壤盐碱性，提高土壤保水能力提供了理论数据。

图1 文献筛选流程和结果

作者研究类型ART方法周期数DFI检测方法∗DFI参考阈值结局指标aNOS评分DuranEH[3]前瞻性IUI154TUNEL12%③7ZiniA[4]前瞻性ICSI60AOT30%①③④8HuangCC[5]回顾性IVF/ICSI217/86TUNEL10%②③7Boe⁃HansenGB[6]前瞻性IVF/ICSI139/47SCSA27%③7BoriniA[7]前瞻性IVF/ICSI82/50TUNEL10%③④8BenchaibM[8]前瞻性IVF/ICSI88/234TUNEL10%③7BungumM[9]回顾性IUI/IVF/ICSI387/388/223SCSA30%③④9LinMH[10]前瞻性IVF/ICSI137/86SCSA27%③④7FrydmanN[11]前瞻性IVF117TUNEL35%②③④8MicińskiP[12]前瞻性ICSI60SCSA15%③7SpeyerBE[13]回顾性IVF/ICSI192/155SCSA30%③④9蒋欢欢[14]前瞻性IVF/ICSI137/50SCSA30%①②③8JiangH[15]前瞻性IVF/ICSI116/63AOT30%①③7丁玉芹[16]前瞻性ICSI63AOT27%①②③7杨晓玉[17]前瞻性IUI482SCSA25%①7

续表1

注：*DFI检测方法：TUNEL：末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记实验；AOT：丫啶橙实验；SCSA：精子染色质结构分析实验；SCD：精子染色质扩散实验。a结局指标：①受精率；②优质胚胎率；③临床妊娠率；④流产率

二、Meta分析结果

1. IUI临床妊娠率：固定效应模型Meta分析结果显示，高DFI组的临床妊娠率低于低DFI组，差异有统计学意义(RR=0.22，95%CI：0.12-0.41，P<0.05)(图2)。

2. DFI与IVF受精率的相关性：随机效应模型Meta分析结果显示，高DFI组的受精率低于低DFI组，差异具有统计学意义(RR=0.90，95%CI：0.86-0.95，P<0.05)(图3)。

3. DFI与IVF优质胚胎率的相关性：固定效应模型Meta分析结果显示，高DFI组的优质胚胎率低于低DFI组，差异具有统计学意义(RR=0.86，95%CI：0.82-0.91，P<0.05)(图4)。

4. DFI与IVF临床妊娠率的相关性：随机效应模型分析结果显示，DFI的增加会导致IVF临床妊娠率降低，差异有统计学意义(RR=0.86，95%CI：0.76-0.98，P<0.05)。由森林图可见，只有TUNEL检测方式能预测IVF临床妊娠率(RR=0.74，95%CI：0.55-0.99，P<0.05)(图5)。

5. DFI与IVF流产率的相关性：固定效应模型Meta分析结果显示，高DFI组的流产率高于低DFI组，差异具有统计学意义(RR=1.65，95%CI：1.05-2.57，P<0.05)(图6)。

6. DFI与ICSI受精率的相关性：随机效应模型Meta分析结果显示，ICSI受精率不受DFI高低的影响(RR=1.01，95%CI：0.98-1.04，P>0.05)(图7)。

7. DFI与ICSI优质胚胎率的相关性：随机效应模型Meta分析结果表示，ICSI优质胚胎率不受DFI高低的影响(RR=1.09，95%CI：1.00-1.18，P>0.05)(图8)。

图2 DFI与IUI临床妊娠率相关性森林图

图3 DFI与IVF受精率相关性森林图

图4 DFI与IVF优质胚胎率相关性森林图

8. DFI与ICSI临床妊娠率的相关性：随机效应模型结果显示，无论采用哪种方式检测，ICSI临床妊娠率均不受DFI高低的影响(RR=0.96，95%CI：0.77-1.19，P>0.05)(图9)。

9. DFI与ICSI流产率的相关性：固定效应模型Meta分析结果显示，高DFI组的流产率高于低DFI组，差异具有统计学意义(RR=1.57，95%CI：1.03-2.39，P<0.05)(图10)。

10. 发表性偏倚分析：参照之前文献方法[30]，对纳入文献≥5篇且有统计学差异的研究组绘制漏斗图，结果显示纳入文献均以合并效应量RR值为中心左右对称散开分布，提示无明显发表偏倚。

讨 论

本次Meta分析共纳入了27篇队列研究文献，文献整体质量良好，选择性偏倚风险小。虽然纳入的文献在方法学和DFI阈值的选择标准、检测方式上存在一定差异，但异质性检验结果可以接受时，不影响数据的合并。对于I2≥50%研究组，根据DFI检测方式的不同采用随机效应模型进行了Meta亚组的分析。

由IUI组纳入的4个研究的合并结果来看，DFI的增加会降低IUI的临床妊娠率(RR=0.22，95%CI：0.12-0.41)(P<0.05)。提示检测精子DNA完整性能很好地预测IUI的妊娠结局，尤其以男方因素为主的不孕不育患者。查钱江等[23]认为，使用密度梯度离心加上游法可显著降低DFI，提示IUI的精液可常规使用密度梯度离心加上游法处理，以提高临床妊娠率。

有研究认为高水平的DFI会对胚胎质量产生不利影响，如减少受精率，降低胚胎质量，减少囊胚形成数量，导致胚胎停育增加等[31-32]。精子DNA损伤可能是导致IVF受精失败的重要原因，因为精子的DNA受到破坏后可能会影响相应蛋白质的转录或合成，进而影响顶体酶原的生成，无法激活顶体酶，顶体酶的活性降低，影响受精。目前评价优质胚胎仅依靠显微镜下对卵裂球分裂程度、细胞数目、细胞均匀程度、碎片多少等进行评价，结果判断主观性较强，而精子DNA完整性可能是从分子水平预测胚胎预后的有效指标之一。卵母细胞虽然可以对轻微损伤的精子DNA进行修复，但是这种修复机制只有在精子DNA损伤<8%时才有效，高于这个水平仍可导致卵母细胞激活障碍，胚胎发育受到限制[33]。本Meta分析也发现，IVF受精率、优质胚胎率、临床妊娠率和流产率均会受到DFI的影响(P<0.05)。

图5 DFI与IVF临床妊娠率相关性森林图

图6 DFI与IVF流产率相关性森林图

图7 DFI与ICSI受精率相关性森林图

图8 DFI与ICSI优质胚胎率相关性森林图

图9 DFI与ICSI临床妊娠率相关性森林图

图10 DFI与ICSI流产率相关性森林图

但在ICSI组中，DFI只与流产率相关(RR=1.57，95%CI：1.03-2.39，P<0.05)。蔡成云等[34]也发现DFI高低对ICSI临床妊娠率造成的差异无统计学意义(P>0.05)。分析其原因，可能与以下因素有关：一是卵母细胞具有一定的修复功能；二是ICSI受精方式中精子没有受到实验室诱发的损伤；三是与IVF比较，ICSI避免了精子释放活性氧对卵母细胞造成的功能损伤，包括修复精子DNA碎片后的受精能力等；四是本次Meta分析所纳入研究的数量和质量有限可能造成一定程度的偏倚。Bungum等[9]的研究数据也显示，当DFI>30%时，ICSI对DFI不敏感。本Meta分析结果显示，当卵巢储备功能正常时，DFI只影响ICSI流产率，因此建议DFI较高时首选ICSI助孕技术，这与费前进等[35]的研究结论相一致。

由于精子DNA检测方式不同，其阐明的DNA损伤也可能不同，因此这些检测的结果或许并不是等价的。SCSA主要检测螺线管连接子位点，SCD测量松懈的完整DNA和外围组蛋白。TUNEL法则通过加入荧光染色核苷酸，可特定分析磷酸二酯键的断裂，能够检测精子单链和双链DNA断裂的碎片，被称为“实际”DNA损伤。本Meta分析中，由IVF临床妊娠率亚组森林图可见，只有TUNEL检测方式能够预测IVF临床妊娠率(RR=0.74，95%CI：0.55-0.99)(P<0.05)。因此，为了更准确地预测ART妊娠结局，使用何种检测方式检测DFI显得尤为重要。

综上所述，以DFI作为评价精子DNA完整性的常规指标，其水平高低对辅助生殖治疗的结局有一定的预测价值，DFI较高时选择ICSI的治疗方式可能更优于常规的IVF。但由于受到纳入研究数量和质量的限制，上述结论还需要开展更大规模的流行病学研究和临床研究来进一步验证。

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[编辑：肖晓辉]

Meta-analysis of predictive value of sperm DNA integrity on assisted reproductive outcome

TAN Yan1， FAN Li-qing2*

1.ChildHealthCareDepartment，ZhuzhouMaternal&ChildHealthHospital，HunanProvice，Zhuzhou412000 2.InstituteofReproductive&StemCellEngineering，CentralSouthUniversity，Changsha410078

Objective： To evaluate systematically the predictive value of sperm DNA integrity on the outcome of intrauterine insemination (IUI)， IVF-ET and ICSI.Methods： The literatures were searched electronically and manually from the databases in both English and Chinese including Medline， Pub Med， Embase， CNKI， VIP and conference information till March 2016. The data were selected and extracted according to inclusion and exclusion criteria， and the quality of research methodology was evaluated by two independent reviewers. Then RevMan 5.3 software was used for Meta analysis.Results： Thirty study including 10 124 cycles were included. Meta analysis showed that elevation of DNA fragmentation index (DFI) reduced clinical pregnancy rate of IUI[RR=0.22， 95%CI(0.12， 0.41)]， IVF-ET fertilization rate [RR=0.90， 95%CI(0.86， 0.95)]， high-quality embryo rate of IVF-ET [RR=0.86， 95%CI(0.82， 0.91)]， clinical pregnancy rate of IVF-ET [RR=0.86， 95%CI(0.76， 0.98)](allP<0.05). Elevation of DFI increased the abortion rates of IVF-ET [RR=1.65，95%CI(1.05， 2.57)] and ICSI [RR=1.57，95%CI(1.03， 2.39)](allP<0.05). Only the TUNEL method was able to predict the clinical pregnancy rate of IVF [RR=0.74， 95%CI(0.55， 0.99)，P<0.05]. There was no significant effect of DFI on fertilization rate， high-quality embryo rate， clinical pregnancy rate in ICSI (P>0.05).Conclusions： Existing evidence suggests that sperm DNA integrity can predict the outcome of the assisted reproduction. When DFI is higher， the outcome of ICSI treatment is better than that of IVF treatment. However， due to the limitations of the number and quality of studies included， the conclusions need to carry out larger epidemiological studies and clinical studies to further validate.

Sperm； DNA integrity； ART； Meta analysis

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.008

2016-03-15；

2016-08-21

谭艳，女，汉族，湖南株洲人，硕士，副主任技师，生殖工程专业.(*