SPINK1在结直肠癌中的表达及其与预后的关系

钱婀娜，徐正顺，于 泳，肖燕景

结直肠癌发病率在男性癌症患者中居第3位，女性癌症患者中居第2位[1]。这种疾病具有侵袭性，即使在目前的治疗方式下仍有大量患者死亡。丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型(serine protease inhibitor Kazal Ⅰ,SPINK1)是一种胰蛋白酶激酶抑制剂[2]，目前已知它与炎症、细胞增殖和癌症的发生有关，基因突变会导致慢性或遗传性胰腺炎。而且，SPINK1表达水平改变与许多癌症的预后有关[3]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种酪氨酸蛋白激酶受体，与其相应配体结合，激活后参与调节细胞内的信号传导，EGFR的过度表达与肿瘤的进展和预后有关[4]。因此，酪氨酸激酶抑制剂被用来抑制肿瘤生长，提高肿瘤细胞对化疗敏感性[5]。本研究利用免疫组织化学技术检测SPINKl和EGFR蛋白在结直肠癌中的表达及探讨与预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料收集郑州市第十人民医院和郑州市中心医院病理科2012年至2013年手术切除并经病理证实为结直肠癌和结直肠腺瘤的石蜡组织标本98例。其中，结直肠癌55例；所有患者术前均未接受化疗、放疗或免疫治疗，手术后进行常规化疗，随访时间2～36个月，疾病进展定义为因结直肠癌死亡或在随访过程中出现新发的转移；本组中有12例出现了新发的转移及疾病相关性死亡。本组中结直肠腺瘤43例，选取40例病理证实癌旁正常组织作为正常对照。结直肠癌中男性35例，女性20例；年龄28～81岁，中位数年龄69.6岁；根据美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)[6]公布的肿瘤分期标准，将结直肠癌分为Ⅰ+Ⅱ期24例，Ⅲ+Ⅳ期31例；临床病理资料，见表1。所有标本均经40 g·L-1福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，HE染色观察细胞形态和组织学结构。鼠抗人SPINK1单克隆抗体(1∶800，Abnova公司，台湾)，兔抗人EGFR多克隆抗体(即用型)及DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)。

1.2方法免疫组织化学染色，采用柠檬酸钠缓冲液高压修复，按试剂盒说明书操作，一抗4 ℃孵育过夜，以PBS代替一抗作为阴性对照，并分别设立阳性对照，新鲜DAB显色。由两位病理学家独立阅片，如有异议，病理学家一起分析最后得出一致结论。SPINKl免疫组化阳性信号定位于细胞质，EGFR阳性信号为细胞膜和/或胞质着色。结果判定[7-8]：①无着色为0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分；②阳性范围记分：每张切片在光镜下随机观察10个高倍视野，各计数100个细胞，计算出阳性细胞百分比，阳性细胞率为0记0分，<10%记1分，10%～50%记2分，>50%记3分。上述2项结果相乘：0～1分为阴性(-)，2～9分为阳性(+)。

1.3统计学处理采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计数资料之间的比较采用χ2检验，两指标间相关性采用Spearman等级相关分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，进行双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1SPINK1和EGFR蛋白在结直肠癌的表达及其与临床病理特征的关系结直肠癌SPINK1蛋白与性别、肿瘤大小、淋巴结有无转移、有无远处转移和肿瘤分期有关(P<0.05)，而与年龄无关(P>0.05)，EGFR蛋白与有无远处转移和肿瘤分期有关，而与年龄、性别、肿瘤大小和淋巴结有无转移均无关(P>0.05)，见表1。

表1 SPINK1和EGFR蛋白在结直肠癌的表达及其与临床病理特征的关系 例

续表

组 别SPINK1+-P值EGFR+-P值无1411205肿瘤分期0.0130.038Ⅰ+Ⅱ159195Ⅲ+Ⅳ283301

注：SPINK1：丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型；EGFR：表皮生长因子受体。

2.2SPINK1和EGFR结直肠癌中SPINK1表达阳性信号定位于细胞质，见图1。EGFR阳性信号为细胞膜和/或胞质，见图2。SPINK1阳性率为78.18%(43/55)，高于结直肠腺瘤20.93%(9/43，P<0.05)及其周围正常黏膜组2.50%(1/40，P<0.05)。结直肠腺瘤及其周围正常黏膜组SPINK1的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结直肠癌中EGFR阳性率为89.09%(49/55)，高于结直肠腺瘤18.60%(8/43，P<0.05)及其周围正常黏膜组7.50%(3/40，P<0.05)。结直肠腺瘤和及其周围正常正常黏膜EGFR的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。Spearman等级相关分析显示SPINK1和EGFR在结直肠癌中表达呈正相关(rs=0.496，P<0.05)。

A:无染色；B:弱表达；C:中等强度表达；D:高强度表达。图1 SPINK1在结直肠癌细胞胞质中的染色强度(免疫组化，×400)

组 别SPINK1/例+-阳性率/%EGFR/例+-阳性率/%结直肠癌组431278.18①49689.09①结直肠腺瘤组93420.93 83518.60 对照组1392.50 3377.50

注：①与结直肠腺瘤组比较，P<0.05。SPINK1：丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型；EGFR：表皮生长因子受体。

2.3SPINK1蛋白的表达与预后的相关性根据随访资料，43例SPINK1阳性的患者中有10例在治疗过程中出现了远处转移或肿瘤相关性死亡，中位生存期为23.31个月。12例SPINK1阴性的患者中有2例在治疗过程中出现远处转移或肿瘤相关性死亡，中位生存期为32.2月。Kaplan-Meie分析显示SPINKl阳性表达的病例相对于阴性者具有较短的生存期或疾病进展期，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

A:正常结肠黏膜；B:结直肠癌中胞质弱表达；C:结直肠癌中胞质中等强度表达；D:结直肠癌中胞质高表达。图2 EGFR在各组中的表达(免疫组化，×400)

图3 SPINKI的表达与结直肠癌患者疾病进展的Kaplan-Meier曲线图

3 讨论

SPINK1是一种由SPINK基因编码的胰蛋白酶抑制剂，由胰腺腺泡细胞分泌成胰液，也被称为胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂(tumor-associated trypsin inhibitor,TATI)或胰腺分泌性胰蛋白酶抑制剂(pancreatic secretory trypsin inhibitor,PSTI)，已知在炎症、细胞增殖和癌症发病中起重要作用。有研究表明在胰腺癌、胃癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌和前列腺癌中SPINK1在组织或血清中的过表达与预后差有关[9]。本研究表明，结直肠癌中SPINK1表达阳性率高于结直肠腺瘤及其周围正常黏膜组织，结直肠癌SPINK1蛋白的表达与性别、肿瘤大小、淋巴结有无转移、远处转移和肿瘤分期有关，提示在结直肠癌进展和转移过程中SPINK1可能具有重要作用，进一步行Kaplan-Meie分析显示，SPINKl阳性表达的患者相对于阴性者具有较短的生存期或疾病进展期，差异具有统计学意义，这一结果与之前Gaber等研究相一致[10-11]。作为丝氨酸蛋白酶的弱抑制剂，SPINK1被认为由于破坏细胞外基质相互作用的平衡而在肿瘤的侵袭、转移和进展中发挥重要的介导作用[12]。有研究表明，SPINK1在肝组织中高表达与肝转移有关，在结直肠癌患者血清中SPINK1水平与结直肠癌患者总体生存率有关[13]，表明SPINK1可能在结直肠癌的发生和发展中发挥作用。

EGFR是一种酪氨酸激酶受体，表达于上皮性肿瘤中[14]。EGFR表达升高参与肿瘤的发生，包括细胞增殖、凋亡、血管生成和转移，与预后不良有关。在70%～80%的结直肠癌患者中发现EGFR过度表达，被认为是靶向治疗的靶点之一[15]。本研究结果表明，结直肠癌中EGFR表达阳性率高于结直肠腺瘤及其周围正常黏膜组织，并且与有无远处转移和肿瘤分期有关，与先前Bansal等的发现相一致[16]，表明EGFR的过表达随着肿瘤组织的恶性转化而逐渐增加，是一个独立的不良预后预测因子[17]。

有研究通过放射免疫法测定显示，SPINK1结合表面受体并刺激成纤维细胞中的DNA合成，在结构上SPINK1包括与表皮生长因子相似的50%的序列同源性和3个链内二硫键，表明SPINK1可作为生长因子发挥作用。SPINK1可以诱导EGFR的二聚化和磷酸化，并通过MAPK通路促进信号转导和细胞增殖[18]。

总之，本研究结果SPINK1的高表达与疾病进展和预后不良有关，Kaplan-Meie分析显示SPINKl阳性表达的病例相对于阴性者具有较短的生存期或疾病进展期SPINK1的表达与EGFR在结直肠癌中表达呈正相关，SPINK1可被视为增生性肿瘤蛋白。二者在结直肠癌中的相互作用和分子机制还需要进一步研究，为未来的临床决策和个体化靶向治疗提供充分依据。

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