β2-AR基因多态性对哮喘患者沙美特罗替卡松吸入治疗疗效的影响

舒敬奎 戴路明 方利洲 张剑青 冯家钢



β2-AR基因多态性对哮喘患者沙美特罗替卡松吸入治疗疗效的影响

舒敬奎 戴路明 方利洲 张剑青 冯家钢

目的 探讨β2-肾上腺素能受体(β2-AR)基因多态性对本地区哮喘患者沙美特罗替卡松吸入治疗的疗效的影响。方法 2013年12月至2015年9月选取本院呼吸内科收治的84例哮喘急性期患者为哮喘组，患者均行沙美特罗替卡松吸入治疗，另选取80例健康体检者为对照组，采用TaqMan-PCR法测定两组β2-AR的16位点(A-G)基因多态性，分析β2-AR基因多态性对哮喘患者沙美特罗替卡松吸入治疗的疗效影响及肺功能的影响。结果 与对照组相比，哮喘组β2-AR16位点中GG型基因及G等位基因频率比例较高(P<0.05)。84例哮喘患者中疗效差组GG型基因及G等位基因频率高于疗效理想组(P<0.05)。哮喘组患者β2-AR中GG基因型患者治疗后肺活量(VC)、肺总量(TLC)、用力呼气肺活量(FVC)、用力呼气肺活量1秒量(FEV1)、用力呼气肺活量1秒率(FEV1/FVC)及一氧化碳弥散量(DLCO)水平低于AA型及AG型，而AA及AG基因型治疗后肺功能指标比较无统计学差异(P>0.05)。结论 哮喘患者中β2-AR的16位点基因多态性可能与本地区哮喘的发生有密切的关系，携带β2-AR变异等位基因G型可能会影响沙美特罗替卡松吸入治疗的效果。

β2-肾上腺素能受体；基因多态性；哮喘；沙美特罗替卡松；治疗效果

支气管哮喘(简称哮喘)是呼吸内科常见的多发性疾病，患者表现为易复发、病程长，给患者身心健康带来较大的影响[1]。患者临床特点为气道炎症反应、免疫功能紊乱及气道高反应性。吸入β2-肾上腺素能受体(β2- adrenergic receptor,β2-AR)激动剂(沙美特罗替卡松)是目前治疗哮喘常用的治疗方法之一，但不少研究发现不同个体间药物疗效存在较大的差异[2]。随着对哮喘药物基因研究的深入，近年发现β2-肾上腺素能受体激动剂在哮喘治疗中的效果受其基因多态性影响，β2-AR基因多态性可能与哮喘发生、病情进展及预后有密切的关系[3]。人类β2-AR基因位于染色体5q31-32基因片段上，β2-AR基因多态性为编码区中第16个位点的精氨酸(Arg)向甘氨酸(Gly)突变[4]，因此本研究将探讨β2-AR基因多态性在本地区哮喘患者发病中的作用机制及其对哮喘患者应用β2-AR激动剂治疗疗效的影响，旨在寻找β2-肾上腺素能受体基因位点遗传效应及药物遗传学标记，为本地区哮喘临床用药提供指导。

资料与方法

一、临床资料

2013年12月-2015年9月选取本院呼吸内科收治的84例哮喘急性期患者为哮喘组，纳入标准：① 均符合中华医学会呼吸病学会分会制定“哮喘防治指南”中对哮喘的诊断标准[5]；② 经支气管激发试验检查可发现患者存在明显的气道高反应性；③ 均签署知情同意书，且所有病例获得医学伦理委员会批准。排除标准：① 其他呼吸系统性疾病；② 心、肝、肾功能不全者；③ 入组前4周呼吸道感染病史、应用过全身糖皮质激素、抗白三烯、抗组胺及缓释茶碱等药物者。男44例，女40例，年龄18-65岁，平均(35.6±2.7)岁，体质量(BMI)23.8-28.5 kg/m2,平均(25.2±2.2)kg/m2；病程2-5年，平均(3.2±0.8)年。另选取80例健康体检者为对照组，患者均无呼吸道疾病或应变性疾病，男 42例，女 38例，年龄 18-72 岁，平均(36.2±2.8)岁，体质量(BMI)23.7-28.8 kg/m2,平均(25.5±2.4)kg/m2，两组性别、年龄、体质量比较无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

二、方法

1 治疗方法：84例哮喘患者采用沙美特罗替卡松干粉剂(厂家：葛兰素史克；规格：60泡/盒×50ug；批号：201509123)吸入治疗，每天2次，持续治疗12周，患者每4周复诊1次，评估治疗效果。根据中华医学会呼吸病学会分会制定“哮喘防治指南”相关标准，将治疗后哮喘患者分为完全控制、部分控制及未控制，将完全控制及部分控制患者设为疗效理想组(n=58)，将未控制患者设为疗效差组(n=26)。

2 基因多态性测定：① 两组患者均抽取静脉血3 mL，应用盐析法提取DNA，待DNA溶解于TE溶液后，测定其在280 nm下的分光光度植，并计算每个样本浓度及纯度，根据所需要的浓度将DNA原液稀释至合适浓度工作液；② 设计DNA引物：上游引物序列 5’-GCTCCGGTAGGTCACG-3’；下游引物序列 5’-CCTGGGTCAAGTGTCGGAG-3’；③ PCR反应体系：分别在DNA样本中加入2 μL 模板DNA，4 μL上游引物，4 μL下游引物，2 μL dNTs，5 μL 10×PCR buffer，32.5 μL，0.5 μL Taq Polymerase；④ PCR扩增条件：样液在94 ℃中预变性5 min，然后变性45 s，退火61 °C 45s，延伸72 ℃ 45 s，末端延伸72 ℃ 5 min，并在退火阶段收集荧光信号。⑤ 采用荧光定量PCR仪测定TapMan探针上的FAM荧光信号。等位基因频率=(2×纯合子+杂合子)/(2×受体人数)。按照Hardy-Weinberg平衡法对群体代表样本进行分析。

3 肺功能测定：哮喘组患者分别于治疗前后应用德国JAEGER公司提供的MAS TERSCREEN肺功能检测系统测定肺功能，检测项目包括肺活量(VC)、肺总量(TLC)、用力呼气肺活量(FVC)、用力呼气肺活量1秒量(FEV1)、用力呼气肺活量1秒率(FEV1/FVC)及一氧化碳弥散量(DLCO)。除FEV1/FVC外，各项指标采用实测值占预计值百分比表示。

三、统计学方法

结 果

一、哮喘组与对照组β2-AR基因型及频次对比

哮喘组患者AA、AG、GG型基因型分别为21.43%、38.09%、40.47%，等位基因A、G频率分别为0.185、0.875，对照组AA、AG、GG型基因型分别为62.50%、35.00%、2.50%，等位基因A、G频率分别为0.725、0.275，(见表1)。

表1 哮喘组与对照组β2-AR基因型及频次对比

二、哮喘患者中疗效差组与疗效理想组β2-AR基因型及频次对比

84例哮喘患者中，疗效理想组AA、AG、GG型基因型分别为27.59%、48.28%、24.13%，等位基因A、G频率分别为0.588、0.412，疗效差组AA、AG、GG型基因型分别为7.69%、15.39%、76.92%，等位基因A、G频率分别为0.789、0.211。(见表2)。

三、哮喘组患者不同基因型治疗前后肺功能指标比较

各基因型治疗前VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平比较差异不显著(P>0.05)，AA型及AG型治疗后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平较治疗前均得到显著改善(P<0.05)，而GG基因型患者治疗前后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平比较无显著差异(P>0.05)，哮喘组患者β2-AR中GG基因型患者治疗后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平低于AA型及AG型，而AA及AG基因型治疗后肺功能指标比较无统计学差异，P>0.05，(见表3)。

表2 哮喘患者中疗效差组与疗效理想组β2-AR基因型及频次对比

表3 哮喘组患者不同基因型治疗前后肺功能指标比较±s)

注：与AA型相比，aP<0.05；与AG型相比，bP<0.05

讨 论

目前关于β2-AR基因16位点基因多态性在不同人群中对哮喘的影响报道不尽相同。Bandaru等[6]对北美哮喘患者进行病例对照组研究发现，β2-AR基因16位点A向G突变与哮喘的发生有密切的关系，而Rumzhum等[7]对欧洲哮喘人群进行研究时未发现β2-AR基因16位点上基因多态性。Werner等[8]在美国黑人哮喘人群中进行病理对照研究未发现β2-AR基因多态性与哮喘发病有关，但β2-AR基因多态性可增强患者血清特异性IgE水平。中国Leite等[9]研究发现，β2-AR基因GG基因型与哮喘发病有关，但与哮喘病情进展无关。本研究入组人群均为本地区哮喘患者，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，表明入选人群代表性好。本研究中哮喘患者GG基因型及G基因频率高于对照组，从而提示GG基因型可能是哮喘发生的危险基因型，而G等位基因可能是本地区哮喘患者遗传易感基因。导致不同地区哮喘患者基因型差异的原因可能与不同种族人群间遗传背景、样本量、研究方法、患者年龄及哮喘类型存在差异有关。

沙美特罗是目前治疗哮喘最常用的药物之一，与丙酸氟替卡松联合应用疗效优于单纯吸入高剂量糖皮质激素[10]。但临床研究发现[11]，部分患者应用沙美特罗替卡松吸入治疗后效果不理想，患者仍出现急性发作，患者对药物治疗存在不同的应答不能单纯认为是疾病严重程度不同或药物依从性差异引起的。冯力等[12]研究认为，导致沙美特罗替卡松治疗哮喘疗效差异的原因与患者β2-AR基因多态性有关。Shah等[13]通过一项随机、分层对照的前瞻性研究发现，哮喘患者应用短效β2受体激动剂治疗时其临床疗效受β2-AR基因多态性影响，因此建议对于A/G基因型哮喘患者应避免应用β2受体激动剂治疗。本研究结果显示，疗效差组AA、AG、GG型基因型分别为7.69%、15.39%、76.92%，疗效理想组AA、AG、GG型基因型分别为27.59%、48.28%、24.13%，比较有统计学意义(P<0.05)，表明β2-AR基因多态性可影响沙美特罗替卡松治疗哮喘的临床效果。

肺功能是用于评价哮喘发病及预后的重要客观指标，哮喘患者临床主要表现为气道功能下降及气流进出气道功能受限，因此通过测定肺功能将有助于反映哮喘患者病情进展及预后情况[14]。本研究结果显示，AA型及AG型治疗后后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平较治疗前均得到显著改善(P<0.05)，而GG基因型患者治疗前后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平比较无显著差异(P>0.05)，哮喘组患者β2-AR中GG基因型患者治疗后VC、TLC、FVC、FEV1、FEV1/FVC及DLCO水平低于AA型及AG型，表明β2-AR基因多态性可影响哮喘患者肺功能，与AA型、AC型相比，GG基因型患者预后较差。陈慧芬等[15]研究认为β2-AR基因多态性不会影响哮喘患者治疗效果，本研究结果与之不尽相同，考虑可能与样本种族性差异、地域差异及样本量差异等因素有关。

综上所述，哮喘患者中β2-AR的16位点基因多态性可能与本地区哮喘的发生有密切的关系，携带β2-AR变异等位基因G型可能会影响沙美特罗替卡松吸入治疗的效果。

[1] 刘琳琳,杨巧玉,何青,等.完全控制支气管哮喘患者用药情况及其对哮喘急性发作的影响研究[J].中国全科医学,2015,4(31):3818-3821.

[2] 陈慧芬,张德平,邱玉英,等.β2肾上腺素能受体基因多态性和支气管哮喘关系的最新研究进展[J].国际呼吸杂志,2013,33(19):1481-1485.

[3] 陈慧芬,张德平,邱玉英,等.β2肾上腺素能受体基因多态性和支气管哮喘关系的最新研究进展[J].中华哮喘杂志(电子版),2013,7(5):356-360.

[4] 鲁衍强,李瑛,郭文竹,等.哮喘相关基因研究进展[J].新医学,2013,44(4):227-230.

[5] 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组,中华医学会全科医学分会.中国支气管哮喘防治指南(基层版)[S].中华结核和呼吸杂志,2013,36(5):331-336.

[6] Bandaru S,Alvala M,Akka J,et al.Identification of Small Molecule as a High Affinity β2 Agonist Irrespectively Targeting Wild and Mutated (Thr164Ile) β2Adrenergic Receptor in the Treatment of Bronchial Asthma[J].Curr Pharm Des,2016,13(2):78-80.

[7] Rumzhum NN,Patel BS,Prabhala P,et al.IL-17A increases TNF-α-induced COX-2 protein stability and augments PGE2 secretion from airway smooth muscle cells: impact on β2-adrenergic receptor desensitization[J].Allergy,2016,71(3):387-396.

[8] Werner K, Neumann D, Seifert R.High constitutive Akt2 activity in U937 promonocytes: effective reduction of Akt2 phosphorylation by the histamine H2-receptor and the β2-adrenergic receptor[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2016,389(1):87-101

[9] Leite N,Lazarotto L,Milano GE,et al.Beta 2-adrenergic receptor gene association with overweight and asthma in children and adolescents and its relationship with physical fitness[J].Rev Paul Pediatr,2015 ,33(4):381-386.

[10] Gupta MK,Asosingh K,Aronica M,et al.Defective Resensitization in Human Airway Smooth Muscle Cells Evokes β-Adrenergic Receptor Dysfunction in Severe Asthma[J].PLoS One,2015,10(5):78-80.

[11] 刘晓华,李大文,伊志刚,等.研究支气管哮喘分期与β2-AR基因多态性的关系[J].临床医药文献电子杂志,2015,5(2):217-217.

[12] 冯力.糖皮质激素联合β2-受体激动剂小剂量吸入治疗哮喘100例[J].陕西医学杂志,2014,4(9):1228-1229.

[13] Shah NJ,Vinod Kumar S,Gurusamy U,et al.Effect of ADRB2 (adrenergic receptor β2) gene polymorphisms on the occurrence of asthma and on the response to nebulized salbutamol in South Indian patients with bronchial asthma[J].J Asthma,2015,52(8):755-762.

[14] 陈敬林,黄湘,谭家余,等.ADRB2基因rs1042713位点多态性与中国人群哮喘易感性关系的荟萃分析[J].中国免疫学杂志,2015,(8):1037-1039.

[15] 陈慧芬,邱玉英.ADRB2基因多态性/单倍型与中国南方汉族人群支气管哮喘相关表型的关系[J].国际呼吸杂志,2015,35(7):485-491.

Impact of β2-AR gene polymorphism on treatment efficacy of salmeterol fluticasone propionate inhalation for patients with asthma

SHUJing-kui,DAILu-ming,FANGLi-zhou,ZHANGJian-qing,FENGJia-gang

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650031,China

Objective To investigate the impact of β2-ARgene polymorphism on treatment efficacy of salmeterol fluticasone propionate inhalation for patients with asthma. Methods 84 patients with acute asthma were selected as the asthma group and 80 cases of healthy subjects were selected as the control group from December 2013 to September 2015. The β2-AR16 loci (AG) of the two groups were assayed with TaqMan-PCR. The asthma salmeterol fluticasone propionate inhalation therapy efficacy and lung function were analyzed. Results The frequency of GG genotype and G allele in β2-AR16 sites was higher in the asthma group than in the control groups (P<0.05), and it was higher in the poor efficacy group than in the good efficacy group (P<0.05). The levels of vital capacity (VC), total lung capacity (TLC), forced expiratory vital capacity (FVC), forced expiratory vital capacity 1 second volume (FEV1), forced expiratory vital capacity 1 seconds ratio (FEV1/FVC) and carbon monoxide diffusing capacity (DLCO) of GG genotype patients were higher than AA and AG genotypes, but there was no significant difference in pulmonary function after treatment between AA and AG genotypes (P>0.05). Conclusion The gene polymorphism of β2-AR16-site may be associated with the incidence of asthma, and G type patients carrying β2-ARvariant allele may have poor salmeterol fluticasone propionate inhalation therapy effect.

β2-adrenergic receptor; gene polymorphism; asthma; salmeterol and fluticasone propionate; treatment effect

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.02.032

650031 云南 昆明，昆明医科大学第一附属医院呼吸内科

2016-06-03]