Nucleophosmin及notch1在肺腺癌中的表达及意义

贺兼斌 刘理静 向志 肖集文 肖海波



Nucleophosmin及notch1在肺腺癌中的表达及意义

贺兼斌1刘理静4向志1肖集文2肖海波3

目的 观察Nucleophosmin蛋白及notch1受体蛋白在肺腺癌组织中的表达并探讨其意义。方法 选择2012，10-2015，06我院确诊的肺腺癌患者的肿瘤标本共107例，采用免疫组织化学染色方法检测Nucleophosmin蛋白和notch1受体蛋白质的表达情况。结果 Nucleophosmin蛋白和Notch1受体蛋白质在肺腺癌组织中皆为阳性表达，临床分期越高，Nucleophosmin蛋白和Notch1受体蛋白质的表达越高，同时Nucleophosmin蛋白和Notch1受体蛋白质在肿瘤细胞的表达随分化程度的升高而降低。结论 Nucleophosmin、Notch1受体蛋白质在肺腺癌组织中的高表达可能与肿瘤的发生，发展，侵袭及转移相关，两者的过表达可能促进肺腺癌的进展，侵袭及转移。

Nucleophosmin；Notch1；肺腺癌；转移

肺癌是危害人类生命的恶性肿瘤之一，中晚期肺癌因转移或瘤体大而无手术机会，综合治疗的主要手段是化疗，但到目前为止，5年生存率仍然很低，不超过15%，治疗失败的主要原因包括化疗耐药和肿瘤复发及转移，在肿瘤的发生及发展过程中，许多基因及基因产物参与了肿瘤的进展过程，其中某些基因及基因产物与肿瘤的侵袭，转移密切相关，探寻这些基因及基因产物有利于揭示肿瘤的发病机理，并使其成为肿瘤靶向治疗潜在的靶标，有可能为肿瘤的治疗开辟新的治疗途征。有研究表明Nucleophosmin、Notch1受体与某些肿瘤的生长，侵袭，转移密切相关[1-2]，但它们与肺腺癌的关系鲜见报道，本研究收集足够样本量的经过病理学确诊的肺腺癌患者肿瘤组织标本，以免疫组织化学方法检测肿瘤组织中Nucleophosmin、Notch1受体表达，探讨其与肺腺癌发生，发展的关系。

资料与方法

一、一般资料

选择2012，10-2015，06我院经电子支气管镜活检、CT引导下经皮穿刺肺活检或转移性淋巴结活检及外科手术确诊的肺腺癌患者的肿瘤标本共107例。其中男41例，女66例，年龄41-76岁，平均56.7岁，依据2009年第7版肺癌TNM分期标准，Ⅰ期15例，Ⅱ期34例，Ⅲ期39例，Ⅳ期19例，低分化31例，中分化43例，高分化33例。所有标本均用10%中性甲醛溶液固定并石蜡包埋保存于我院病理标本库，行4um连续切片，由2 位有经验的病理专家确诊，符合2015年的WHO肿瘤组织学分类标准[3]及2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌新分类标准[4]。

二、主要试剂

一抗小鼠抗人Nucleophosmin单克隆抗体和羊抗人Notch1 多克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司，免疫组织化学检测试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

三、免疫组织化学检测

对入选病例的肿瘤组织及癌旁组织标本使用免疫组织化学法检测Nucleophosmin、Notch1受体蛋白质的表达，分析Nucleophosmin、Notch1受体蛋白质的表达与肿瘤临床及病理分期的关系。免疫组织化学检测步骤按试剂盒操作说明书严格进行，一抗分别为小鼠抗人Nucleophosmin单克隆抗体、羊抗人Notch1 多克隆抗体，抗体稀释浓度为1 ∶100，阴性对照为用PBS缓冲液代替一抗。结果判断：Nucleophosmin蛋白为肿瘤细胞胞核中出现棕黄色颗粒,Notch1受体蛋白质为肿瘤细胞细胞质内及细胞膜上呈棕黄色颗粒，蛋白表达结果采用全自动图像分析系统测定平均灰度值表示，平均灰度值越高，蛋白表达越强。

四、统计学方法

结 果

一、不同临床分期患者肿瘤中Nucleophosmin、Notch1受体蛋白质的表达

Nucleophosmin蛋白的表达：肺腺癌各临床分期标本Nucleophosmin皆为阳性表达，随肿瘤进展，临床分期越高，Nucleophosmin的表达越高，Ⅰ期与Ⅱ期比较差异无显著性(P>0.05)，其它各期比较有差异显著性(P<0.05)，Nucleophosmin蛋白在癌旁组织中表达极低，与肿瘤组织比较有差异显著性(P<0.05)；Notch1受体蛋白质的表达：肺腺癌各临床分期标本Notch1受体蛋白质皆为阳性表达，与Nucleophosmin蛋白的表达类似，随肿瘤进展，临床分期越高， Notch1受体蛋白质的表达越高，各期比较有差异显著性(P<0.05)，而癌旁组织中表达极低，与肿瘤组织比较有差异显著性(P<0.05)，各临床分期患者肿瘤中Nucleophosmin、Notch1受体蛋白质的表达(见表1，图1)。

表1 不同临床分期患者肿瘤中Nucleophosmin、 Notch1受体蛋白质的表达

二、不同分化程度患者肿瘤中Nucleophosmin、Notch1受体蛋白质的表达

图1 不同临床分期患者肿瘤中Nucleophosmin蛋白质和Notch1受体蛋白质的表达(SP×100)

Nucleophosmin在肺腺癌细胞的表达随分化程度的升高而降低，低分化肺腺癌表达最高，高分化肺腺癌表达最低，各组间比较有差异显著性(P<0.05)；Notch1受体蛋白质的表达与Nucleophosmin表达类似，各组间比较有差异显著性(P<0.05)，各分化程度患者肿瘤中Nucleophosmin、Notch1受体蛋白质的表达(见表2，图2)。

图2 不同分化程度患者肿瘤中Nucleophosmin蛋白质和Notch1受体蛋白质的表达(SP×100)表2 不同分化程度患者肿瘤中Nucleophosmin、 Notch1受体蛋白质的表达

分化程度nNucleophosmin灰度值Notch1灰度值低分化31147.02±6.19139.26±5.43中分化4389.77±4.8186.37±4.52高分化3365.14±4.2361.58±4.39

讨 论

肺癌是恶性程度较高的肿瘤，它严重损害患者的健康和生命，其发病率和死亡率皆高，是发病率和死因第一位的恶性肿瘤[5-6]。在上世纪中叶，鳞癌是肺癌的主要组织学亚型，腺癌所占比例极少仅约为5%，但近年来，肺腺癌的发病率在快速上升[6]。因肺腺癌组织内血管丰富，淋巴结和血行转移早，进展快，导致疗效差，预后不佳，因此，探寻肺腺癌的有效治疗方案或寻找其潜在的治疗靶标具有重要的意义。恶性肿瘤的发生及发展与多种癌基因及基因产物过度表达，以及肿瘤抑制基因失活或基因产物的缺失密切相关[7-8]，因此, 进一步研究新的基因功能改变与肺癌发生发展及其恶性特征的关系，对进一步揭示肺癌发生发展的可能机理、设计合理的治疗药物抑制肺癌细胞浸润或增强其对放化疗的敏感性及判断患者预后和提高我国肺癌的治疗水平都具有积极意义。既往有较多研究表明Nucleophosmin、Notch1受体参与了某些肿瘤的生长，侵袭和转移[1-2]，但它们与肺腺癌的关系鲜见报道，本研究通过检测Nucleophosmin和Notchl在肺腺癌组织中的表达，试图初步分析与其与肺腺癌发生发展、侵袭和转移的关系。

Nucleophosmin是主要的核仁磷酸化蛋白，它参与了rRNA前体加工、RNA装配及合成、染色体复制、调节抑癌基因p53和p14的活性及作为分子伴侣防止蛋白集聚等病理和生理过程，Nucleophosmin还参与监控核仁活性及细胞增殖[9-10]。有研究[11-12]表明Nucleophosmin在多种肿瘤组织中过度表达，具有促进细胞恶性转化、促进癌细胞增殖和抑制凋亡的作用，其高水平表达与恶性肿瘤的进展阶段呈正相关，Nucleophosmin在多种实体肿瘤中存在过度表达，甚至可作为胃癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌的肿瘤标志物，但其与肺癌的关系少见报道，未见Nucleophosmin与肺癌发生发展及侵袭和转移的研究报道。在本研究中，我们发现Nucleophosmin在肺腺癌中的表达随患者的临床分期的升高而增加，除Ⅰ期和Ⅱ期之间比较无显著性差异外，其它各组比较皆有显著性差异(P<0.05)，在各分化程度肺腺癌比较，随分化程度降低，Nucleophosmin在肺腺癌中的表达增加，各组间比较有显著性差异(P<0.05)，不同临床分期和不同分化程度的肺腺癌组织中Nucleophosmin蛋白的表达均存在差异，且随着临床分期的升高和细胞分化程度的降低，染色程度不断加深，Nucleophosmin蛋白表达的灰度值升高，这可能与肿瘤细胞后期的生长和浸润转移有一定的关系。以上结果表明Nucleophosmin在肺腺癌中具有类似癌基因的功能，检测Nucleophosmin的表达情况可能对肺癌早期诊断、指导治疗、预后预测有一定价值。但Nucleophosmin在肿瘤进展中的具体作用机制还不完全明了，可能与Nucleophosmin可以导致c-myc稳定性增强，p53 基因失活，进而促进细胞恶性转化有关[13-14]，也可能与Nucleophosmin通过促进PCNA的表达促细胞增殖有关[15]。Notch是一种单次跨膜受体蛋白，Notch信号通路具有高度保守性，许多肿瘤的发生发展均与Notch信号通路失调有关，其中Notch1是Notch信号通路中的重要受体，在多种肿瘤形成中发挥重要作用[16-17]。有研究报道在多种肿瘤中均发现Notch1的异常表达，但它在不同肿瘤中发挥的作用却并不相同，在某些肿瘤中呈现促癌作用，可是在另一些肿瘤中却呈抑癌作用，也有研究表明即使在同一种肿瘤发生的不同时期Notch1起的作用也不相同[18-19]，近年来Notch1在肺癌中的作用也逐渐成为研究热点，有研究表明Notchl在非小细胞肺癌中高表达，与淋巴结转移、临床分期呈正相关[20]，本研究中发现，Notchl在肺腺癌的表达随临床分期的升高而升高，各组间比较有显著性差异(P<0.05)，同时随细胞分化的减低而增加，各组间比较有显著性差异(P<0.05)，本研究发现在肺腺癌组织中Notch-1的阳性表达随临床分期明显上调，表明Notch-1在肺腺癌的发生过程中起到了促癌作用，另发现Notch-1的表达随肺腺癌分化程度降低而增高，推测Notch-1可能通过抑制细胞分化促进肺腺癌的发展， Notch-1高表达与肺腺癌组织分期、病理分级、临床分期具有相关性，说明其与肺腺癌的恶性程度及侵袭性呈正相关，Notch-1促进肺腺癌发生，发展，侵袭和转移的机制可能与Notch信号通路参与上调VEGF，竞争性结合核因子NF-κB 抑制因子，上调NF-κB等促进肿瘤微血管的形成，诱导细胞增殖[20]有关， 而Notch-1在肿瘤中的不同作用可能与肿瘤细胞类型、生长背景和肿瘤干细胞有关[21]。

综上所述，Nucleophosmin、Notch1受体蛋白质在肺腺癌组织中的异常高表达可能促进肺腺癌的进展，侵袭及转移，两者可能成为新的评价肺腺癌肿瘤患者预后的指标和治疗新靶点，但两者在肺腺癌中的具体作用机制及两者的交互作用有待于进一步研究。

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Expression and significance of Nucleophosmin and Notch1 in lung adenocarcinoma

HEJian-bin,LIULi-jing,XIANGZhi,XIAOJi-wen,XIAOHai-bo

DepartmentofRespiration,theFirstPeople'sHospitalofHuaihua,Huaihua,Hu'nan418000,China

Objective To observe the expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein in lung adenocarcinoma and to discuss its significance. Methods A total of 107 patients with lung adenocarcinoma, who were admitted to our hospital from October 2012 to June 2015, were enrolled in the study. Immunohistochemical assay was used to analyze the expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein in lung adenocarcinoma. Results Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein were positive expression in lung adenocarcinoma, and the expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein was higher at high clinical stage than at low clinical stage, while it in tumor cells decreased with the rise of differentiation degree of the tumor. Conclusion The high expression of Nucleophosmin protein and Notch1 receptor protein in lung adenocarcinoma may be closely related with tumor occurrence, development, invasion and metastasis. The over expression of them in lung adenocarcinoma may promote progress, invasion and metastasis.

Nucleophosmin; Notch1; lung adenocarcinoma; metastasis

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.02.004

湖南省卫生厅科研基金(No B2013-157)

1. 418000 湖南 怀化，怀化市第一人民医院呼吸内科 2. 418000 湖南 怀化，怀化市第一人民医院肿瘤中心 3. 418000 湖南 怀化，怀化市第一人民医院病理科 4. 418000 湖南 怀化，湖南医药学院临床医学院

2016-07-06]