基于超高效串联质谱的氨基酸代谢组学预测晚期乳腺癌化疗反应初探*

徐君南 李晓睿 孙涛

近年来，乳腺癌的死亡率随着手术、化疗、内分泌治疗和靶向治疗等综合治疗水平提高而降低［1］，但晚期乳腺癌患者的预后仍不佳，生存质量不理想，这与肿瘤耐药和个体化差异密不可分。在肿瘤个体化治疗时代，化疗在乳腺癌多学科综合治疗中仍占重要地位，原发性耐药严重影响化疗的疗效。目前，包括CEA在内的肿瘤标志物尚不能对晚期乳腺癌化疗疗效进行评价，影像学监测肿瘤疾病进展至少需要化疗2～4个疗程。因此，临床上亟需用于早期评估化疗疗效的生物标志物。代谢紊乱与多种常见癌症包括乳腺癌的发生发展密切相关［2］，研究显示体内循环血液中的多种氨基酸可作为鉴别乳腺肿瘤良恶性的生物标志物［3-4］。本研究基于超高效串联质谱（LC-MS/MS）检测氨基酸，探讨其含量水平变化与晚期乳腺癌患者化疗敏感性之间的相关性，及能否较影像学更早预测化疗疗效。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2015年3月至2016年10月73例有远处转移并于辽宁省肿瘤医院行化疗的女性晚期乳腺癌患者，穿刺活检的组织学确诊为乳腺癌来源。对有明确预后的患者，分为恶化（疾病进展）组43例和好转（完全缓解、部分缓解和疾病稳定）组30例。分别采集所有患者在化疗前和化疗第1个疗程后的外周血2 mL，分析氨基酸含量水平的变化。

1.2 方法

1.2.1 血液样本收集及处理 采用EDTA真空抗凝管收集患者全血2 mL，收集血液后必须在2 h内分离血浆和血细胞，分离条件为常温或4℃，3 000 r/min离心10 min，分离的血浆和血细胞样本置于-80℃冰箱保存备用。血浆样本用于氨基酸检测。

1.2.2 血清中氨基酸含量水平的检测 根据Tan等［5］报道的血清氨基酸检测方法进行优化，基于LCMS/MS平台，将样品盘置于60℃恒温和N2下，50℃吹干。样品吹干后，加入60 μL衍生试剂，密封，60℃孵育15～30 min进行衍生化。复溶、进样衍生后溶液N2下，50℃吹干。使用100 μL流动相（80%乙腈+20%水+0.02%甲酸）再溶解吹干物，取20 μL进样，进行LC-MS/MS分析。共检测33种氨基酸，包括作为内标的正缬氨酸及甘氨酸等32种氨基酸。

1.2.3 疗效评价 对所有患者采用RECIST1.1标准对实体瘤化疗疗效进行评估，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）与进展（PD）。CR为治疗后肿瘤病灶完全消失；PR为肿瘤病灶大小缩小≥30%，且无新病灶出现；SD为肿瘤病灶大小无明显变化，包括肿瘤病灶大小缩小不到＜或增大＜20%；PD为肿瘤病灶大小增大≥20%或出现新病灶。好转组包括CR、PR和SD患者，恶化组包括PD患者。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料呈偏态分布，采用中位数（上/下四分位数）表示；计数资料采用频数表示。临床特征与化疗疗效之间相关性采用Fisher's精确检验，基线与预后差异比较采用独立两样本t检验，t值为负数表示预后上升，t值为正数表示预后下降。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 晚期乳腺癌患者的疗效

73例患者中，中位年龄为54（32～78）岁，行化疗2～4个疗程后行疗效评估。其中好转组30例中无CR、13例为PR、17例为SD，恶化组43例均为PD。好转组中绝经后、ER阳性、PR阳性、HER-2阳性和Ki-67阳性患者的比例分别为34.88%（15/43）、45.24%（19/42）、45.71%（16/35）、47.06%（8/17）和33.33%（12/36），好转组与恶化组中的绝经后、ER阳性、PR阳性、HER-2阳性和Ki-67阳性进行比较差异无统计学意义。好转组及恶化组患者行一线、二线和多线治疗的比例分别为36.7%（11/30）、33.3%（10/30）和30.0%（9/30）及39.5%（17/43）、25.6%（11/43）和34.9%（15/43），治疗线数与患者预后之间无相关性（表1）。

表1 73例晚期乳腺癌患者的临床特征与化疗疗效之间相关性Table 1 Correlation between the clinical characteristics and chemotherapy response in 73 patients with advanced breast cancer

2.2 晚期乳腺癌患者行联合或单药化疗方案与疗效之间相关性

73例患者的治疗方案中，11例曲妥珠单抗治疗包括曲妥珠单抗联合紫杉醇（HT）、卡培他滨（HX）、长春瑞滨（HN）及紫杉醇和卡培他滨（HTX），25例联合化疗方案包括吉西他滨联合顺铂（GP）、吉西他滨联合紫杉醇（GT）、紫杉醇联合卡培他滨（TX）、长春瑞滨联合卡培他滨（NX）和长春瑞滨联合顺铂（NP），37例单药化疗方案包括紫杉醇（T）、卡培他滨（X）和长春瑞滨（N）等，治疗方案与患者疗效无相关性（P＞0.05，表2）。

2.3 晚期乳腺癌患者行化疗前和化疗第1个疗程后的氨基酸含量水平的比较

32种氨基酸含量水平为3～180 000 pmol/L。与基线相比，好转组的甘氨酸（图1A）和L-谷氨酰胺含量水平显著上升，而恶化组显著下降，可以作为区分疗效的主要标志物；好转组的肌氨酸（图1B）含量水平显著下降，而恶化组变化不明显；好转组的2-吡咯甲酸（图1C）、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、O-乙酰丝氨酸、DL-蛋氨酸亚砜、L-苯丙氨酸、L-瓜氨酸、L-酪氨酸和L-犬尿氨酸共9个氨基酸含量水平显著上升，而恶化组变化不明显；好转组的L-丙氨酸（图1D）和L-组氨酸的含量水平变化不明显，而恶化组显著下降；好转组的L-天冬酰胺（图1E）和L-脯氨酸的含量水平变化不明显，而恶化组显著上升；好转组和恶化组的L-苏氨酸（图1F）、牛磺酸、亚氨基二乙酸和L-谷氨酸的含量水平均显著上升；好转组和恶化组的α-甲基-β-丙氨酸、亚磺酸、L-缬氨酸、4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸、4-胍基丁酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰-L-天门冬氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸和羟基苯乙酰甘氨酸含量水平均无明显变化（表3）。

表2 73例晚期乳腺癌患者的治疗方案与化疗疗效相关性Table 2 Correlation between the therapy regime and response to chemotherapy of 73 patients with advanced breast cancer

图1 73例晚期乳腺癌患者恶化组和好转组中基线与预后代表性氨基酸含量水平比较Figure 1 Comparison of the representative aminoacid levels between the baseline and prognosis in the deterioration and improvement groups in 73 patients with advanced breast cancer

表3 73例晚期乳腺癌患者的好转组和恶化组基线与预后的氨基酸含量水平比较Table 3 Comparison of the aminoacid levels between the baseline and prognosis in the improvement and deterioration groups in 73 patients with advanced breast cancer

3 讨论

LC-MS/MS作为遗传代谢性疾病的早期检测和诊断平台，结合色谱的高分离性能和质谱的高鉴别特点，具有高特异性、高精准度和高自动化程度的优势。目前乳腺癌的化疗疗效评价主要是依靠影像学，通过观察肿瘤体积判断治疗效果，但影像学监测肿瘤疾病进展至少需要化疗2～4个疗程。研究显示，化疗后肿瘤自身以及肿瘤微环境中氨基酸代谢水平的变化可能早于肿瘤体积变化［6-7］，因此可根据肿瘤微环境中氨基酸代谢组学的变化来反映肿瘤组织的变化。氨基酸的影响因素为多方面，包括疾病状态、营养状况和饮食等。本研究结果显示，好转组的甘氨酸和L-谷氨酰胺含量水平显著上升，而恶化组显著下降，可以作为区分疗效的主要标志物；好转组的肌氨酸含量水平显著下降，而恶化组变化不明显。甘氨酸、L-谷氨酰胺和肌氨酸这3个代谢指标可用来指导乳腺癌患者的预后，为优化晚期乳腺癌个体化治疗策略提供依据。乳腺癌患者的谷氨酸和天门冬氨酸含量水平显著低于健康人群的含量水平［8-9］。关于氨基酸含量水平变化与乳腺癌疗效相关性研究，有报道发现术前氨基酸含量水平与乳腺癌新辅助化疗疗效呈正相关［10］，且在恶性黑色素瘤患者中可见部分氨基酸成分与蒽环药物化疗疗效呈正相关，其中基于月桂酰胺和白三烯B4二甲基酰胺建立预测化疗有效率的模型具有较高的敏感性和特异性［5］。Yoon等［11］研究显示，与乳腺癌不同分子分型有关的肌氨酸的代谢蛋白GNMT、SARDH和PIPOX表达存在显著性差异，有助于分子分型诊断及预后评价。

综上所述，本研究初步结果表明，甘氨酸、L-谷氨酰胺和肌氨酸的含量水平在化疗第1个疗程后的变化对晚期乳腺癌化疗疗效具有一定的预测价值，较影像学检查可能更早预测化疗疗效，有助于优化晚期乳腺癌的治疗策略。本研究尚存在一定的局限性，病例数相对较少，涉及化疗方案较多。因此，本研究的可重复性和可靠性还有待在大样本的前瞻性研究中进一步证实。

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