胃癌患者血清miR-26a/b的表达水平及诊断价值*

司怡然 张海洋 王艺 邓婷 白明 宁涛 张乐 巴一

据2015年研究统计，胃癌居世界肿瘤发病率第5位，死亡率居第2位［1］。每年约有42.6%的新发胃癌病例来自中国［2］，且进展期胃癌的中位生存时间≤12个月［3］。胃癌恶性程度高、发生转移早是其预后差的原因之一。研究发现70%的胃癌患者在诊断时已是晚期，失去了外科手术的机会［4］，因此胃癌的早诊率低也是造成其预后差的主要因素。尽管目前一些分子标志物如CEA、CA72-4及CA19-9等对于进展期胃癌诊断有较高的灵敏度，但对于早期胃癌诊断缺乏明显意义［5］。因此有必要探索一种新的特异性和敏感性高的肿瘤标记物应用于胃癌的早期诊断，帮助患者延长生存。miRNA是一类保守的非编码小分子RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译。近年来关于miRNA的研究表明，外周血miRNAs的种类及表达水平在正常人及肿瘤患者或其他疾病状态下存在显著差异，且外周血miRNAs作为肿瘤的一种非有创性诊断的生物标记物逐渐成为新的研究热点［6］。本课题组在之前的研究中筛选了胃癌患者血清miRNAs的表达谱，发现miR-26a/b在胃癌患者与正常人中表达存在差异［7］。因此，本文旨在研究胃癌患者血清miR-26a/b的表达水平与其临床病理特征的关系，并探讨miR-26a/b作为胃癌早诊生物学标志物的价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料

随机选取2016年6月至10月于天津医科大学肿瘤医院就诊的胃癌患者121例。经病理证实均为胃癌，且均为初诊，无任何治疗。121例患者中，男性58例，女性63例，中位年龄（63.5±10.0）岁。另随机选取2016年4月于天津医科大学肿瘤医院体检中心体检的116例健康志愿者作为对照，其中男性66例，女性50例，中位年龄（35.8±7.1）岁；排除肿瘤性疾病。本研究所有血清标本及组织标本的采集和使用均征得患者或其家属知情同意，得到天津医科大学肿瘤医院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 血清标本：清晨，空腹条件下，采集5 mL静脉全血，促凝管中保存，3 000 r/min离心15 min后收集上清液于无RNA酶的1.5 mL离心管中。组织标本：收集以上患者手术切除的胃癌组织标本及正常组织（距肿瘤边缘＞5 cm）标本共16对（16例患者，共32例标本），其中男性9例，女性7例，中位年龄（64.2±10.0）岁，标本大小为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，手术切除的新鲜标本立即放入液氮冻存。以上所有血清及组织标本均置于-80℃冰箱保存，使用时取出。

1.2.2 RNA提取及qRT-PCR定量 严格按照TRIzol（Invitrogen，美国）说明书提取血清及组织标本总RNA，采用紫外分光光度计（NanoDrop，美国）测定RNA的质量和浓度。取约2 μL总RNA，依照Takara（美国）公司的逆转录酶及产品说明书，按16℃15 min、42℃1 h、85℃5 min进行逆转录，制备cDNA完成后将EP管置于-20℃条件下保存。使用探针法进行qRT-PCR检测，按照以下反应条件进行：95℃5 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min（最后两步共计40个循环）。每组实验均以管家基因U6 snRNA分子表达量作为内参，Ct值定义为荧光信号达到设定阈值时PCR所经过的循环数，所有样品均设3个副孔，取平均Ct值，ΔCt值定义为各样本中目的miRNA的平均Ct值与内参基因平均Ct值之差，2-ΔCt为该样本中目的基因相对于内参基因的表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料采用描述。两样本均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析。检验水准α＜0.05。采用GraphPad Prism 7.0a（GraphPad Software Inc，美国）绘图。受试者工作曲线（ROC）下面积（area under the ROC curve，AUC）评价miR-26a和miR-26b作为一种诊断方法是否具有临床应用价值。结果判定AUC≤0.5为无诊断价值，0.5＜AUC≤0.7为诊断准确性较低，0.7＜AUC≤0.9为诊断准确性较好，AUC＞0.9为诊断准确性最高［8］。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-26a/b在胃癌患者与正常人血清标本及胃癌组织与癌旁组织中表达的比较

胃癌组患者血清miR-26a的表达量为1.60±1.02，对照组为5.35±0.44，两组差异有统计学意义（P＜0.001）。胃癌组患者血清miR-26b的表达量为1.44±0.71，对照组为5.35±0.71，两组差异有统计学意义（P＜0.001）。两组血清miR-26a/b的表达水平见图1。该结果表明胃癌患者血清中miR-26a/b的含量明显低于正常人。为了验证miR-26a/b在胃癌中的表达，本研究进一步在组织水平对miR-26a/b的相对表达含量进行检测，选取16对胃癌及癌旁正常组织。结果显示，胃癌组织中miR-26a/b的相对含量低于癌旁正常组织，与血清中的结果具有一致性（图2）。

图1 胃癌患者及正常人血清标本中miR-26a/b的相对表达量Figure 1 Relative expression levels of serum miR-26a/b in GC and control

2.2 胃癌患者血清miR-26a/b表达水平与临床病理特征的关系

本组临床病理资料包括性别、年龄、吸烟饮酒史、家族史、部位、组织学类型、分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移、浸润深度等。结果表明，Ⅰ期患者血清中miR-26a/b的相对表达量明显高于Ⅱ期及Ⅲ期患者，而Ⅳ期患者血清中miR-26a/b的含量较少；T1+T2期患者血清中miR-26a的相对表达量高于T3+T4期；无淋巴结转移的患者血清中miR-26a相对表达量高于有淋巴结转移的患者。根据统计学分析，血清miR-26a/b的相对表达量与TNM分期有关，且miR-26a的相对表达量与浸润深度及有无淋巴结转移也具有相关性，以上结果差异具有统计学意义（P＜0.05）。而miR-26a/b的相对含量与性别、年龄、分化程度、吸烟饮酒史等无显著相关性（P＞0.05，表1）。对于不同TNM分期、有无淋巴结转移及不同浸润深度，胃癌患者的TNM分期越晚、肿瘤的浸润程度越深、涉及有淋巴结转移等情况，miR-26a/b的表达量越低（图3～5）。由此可见，胃癌患者血清miR-26a/b的相对含量也可提示患者的分期及预后。

2.3 ROC曲线分析血清miR-26a和miR-26b对胃癌的诊断价值

从上述结果可以看出，血清miR-26a/b的相对含量与胃癌患者某些临床病理特征具有一定相关性，本研究通过ROC曲线评估血清miR-26a/b作为胃癌生物学标记物的诊断价值。血清miR-26a诊断胃癌的ROC曲线下面积（AUC）为 0.828（95%CI：0.776～0.881），灵敏度和特异度分别为73.3%、81.0%；血清miR-26b诊断胃癌的AUC为0.853（95%CI：0.801～0.906），灵敏度和特异度分别为68.1%、99.2%（表2），ROC曲线见图6。

图2 胃癌组织及癌旁组织中miR-26a/b的相对含量Figure 2 Relative expression levels of miR-26a/b in GC tissues and normal tissues

表1 血清miR-26a/b的相对含量与胃癌患者临床病理特征的关系Table 1 Relationship between the expression of serum miR-26a/b and clinicopathological features of GC patients

表1 血清miR-26a/b的相对含量与胃癌患者临床病理特征的关系（续表1）Table 1 Relationship between the expression of serum miR-26a/b and clinicopathological features of GC patients

图3 不同TNM分期患者血清miR-26a/b的相对含量Firuge 3 Relative expression levels of serum miR-26a/b of patients with different TNM stages

图4 有无淋巴结转移时患者血清miR-26a/b的相对含量Firuge 4 Relative expression levels of serum miR-26a/b of patients with different lymph node metastasis

图5 不同浸润深度患者血清miR-26a/b的相对含量Firuge 5 Relative expression levels of serum miR-26a/b of patients with different invasion depth

表2 患者血清miR-26a/b诊断胃癌的灵敏度、特异度Table 2 Sensitivity and specificity of serum miR-26a/b for diagnosis of GC

图6 胃癌患者血清miR-26a/b的ROC曲线Firuge 6 ROC curve analysis of serum miR-26a/b in GC patients

3 讨论

如何对恶性肿瘤做到早期诊断是值得人们关注的问题，尤其是血清肿瘤标志物的临床应用，使部分类型的肿瘤患者生存获益，降低了患者的死亡率。然而对于胃癌，目前难以通过早期的症状及体征觉察，并且临床常用的CEA、CA19-9、CA72-4等肿瘤标志物缺乏特异性［9］，因此胃癌的早期诊断始终是临床医生面临的一个巨大难题。miRNAs是动植物中发现的一类内源性的起重要调控功能的非编码RNA，其通过与靶基因mRNA碱基配对，引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译来发挥调控作用［10］，并且已有研究发现miRNAs参与多种肿瘤细胞的发生发展、侵袭及转移，起着原癌基因或抑癌基因的作用［11-13］。尽管miRNAs的生物功能并未被完全了解，但分析显示大部分类型肿瘤的miRNAs表达谱与正常组织之间存在显著差异，在外周血中也发生了特异性的改变［14］。已有研究证实，原发肿瘤组织与血清中miRNAs的表达水平保持一致性，即血清中miRNA水平可以在某种程度上反映出原发肿瘤组织中miRNA的水平［15-16］。但与肿瘤组织相比，血清易于取材，创伤较小，同时研究证实血清中miRNA不会随着外界的放置时间、pH值及温度的改变而发生显著性的变化［17］，因此血清miRNA有望作为一种新型的肿瘤标志物用于指导肿瘤的诊断和治疗，并为有效地监控和预防肿瘤复发提供了新途径。

近年来，部分学者已开始着手研究外周血中miRNAs作为胃癌早期诊断标记物的可行性。Tsujiu⁃ra等［18］首次报道了血浆miRNA能够作为胃癌诊断的潜在分子标志物，之后陆续发现多种miRNA与胃癌早诊相关［19-20］。Zheng等［20］对胃癌患者及健康人外周血miR-21的表达水平检测后发现，miR-21在胃癌患者外周血中的含量远高于健康人，并且与肿瘤的TNM 分期相关。Song等［21］研究证实miR-221、miR-744和miR-376联合诊断胃癌的灵敏度和特异度分别为82.4%和58.8%，且miR-221和miR-376c与胃癌的分化程度呈负相关。另有研究证实miRNA可以作为胃癌是否发生转移及预后相关的分子标志物［22-23］。因此，miRNAs多样化的功能与“角色”，使其在胃癌等多种恶性肿瘤的研究中成为焦点。

基于本课题组之前的研究成果，再次回顾胃癌血清miRNA表达谱，发现miR-26家族在胃癌患者血清与正常人血清中的表达差异显著［7］。miR-26a-1、miR-26a-2、miR-26b是miR-26家族中的3种亚型，分别位于3、12、2号染色体。miR-26a-1和miR-26a-2的成熟体miRNA具有相同的序列，与miR-26b成熟体miRNA有2个核苷酸不同［24］。与其他功能及作用已被证实的miRNA相比，miR-26a/b在恶性肿瘤中的“角色”目前仍然是有争议的话题。如在肝细胞癌中，miR-26a/b通过阻滞HGF/c-Met信号通路，抑制肿瘤细胞的增长及血管生成［25］。在乳腺癌中，同样被证实担当抑癌基因的“角色”［26］。但是在胶质瘤、肺癌及胆管癌中，miR-26a/b可以促进肿瘤细胞的增长及转移，发挥原癌基因的作用［27-29］。目前miR-26a/b与胃癌的相关性研究不多见，仅个别研究提示miR-26b通过KPNA2/c-Jun通路，抑制胃癌细胞增长［30］。因此，血清miR-26a/b与胃癌的相关性及其能否成为胃癌早诊的指标成为本研究的目的及重点。

本研究通过对121例胃癌患者及116例正常人的血清标本检测后发现，miR-26a/b在胃癌患者血清中表达显著降低，且组织水平也得到了相同的结果。通过与患者临床病理特征进行分析，发现miR-26a/b的表达与TNM分期、浸润深度、淋巴结转移情况相关，且进一步探讨发现分期越晚的患者，血清中miR-26a/b的表达含量越低，因此miR-26a/b也可能作为预测胃癌患者临床分期及预后差异的潜在生物学指标。通过ROC曲线证实miR-26a/b的AUC分别为0.828和0.853，具有较高的诊断价值。

综上所述，血清miR-26a/b有望成为新的胃癌血清肿瘤标志物，为胃癌的早期诊断提供更为便捷、有效的检测手段，为减低胃癌的死亡率及改善预后提供新的可能的研究方向。但本研究也存在诸多不足，为了真正将miR-26a/b作为胃癌早诊指标应用于临床，需要大规模样本进行广泛验证，此部分数据亟待扩充；另一方面，此指标在灵敏度及特异度方面是否优于现有的胃癌肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA72-4等，此方面的比较也值得进一步探讨。

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