LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌中表达及临床意义

张静怡 单丽珠 张洁 张仑

胃癌是常见的消化道肿瘤之一，流行病学研究推测至2020年全球每年新发胃癌将达80万例［1］。胃癌的发生发展是一个多因素和多步骤的过程，其中涉及一系列分子生物学的变化，并与遗传和环境因素密切相关。目前经典的生物标志物和分期系统存在一定局限性，因此探索敏感度和特异度较高的肿瘤标记物，早期发现胃癌，能够提高胃癌患者生存率［2］。溶酶体相关4次跨膜蛋白B（lysosome-associated transmembrane protein 4β，LAPTM4B）-35基因于2000年首次通过荧光差异显示技术在原发性肝细胞癌克隆出来，LAPTM4B表达蛋白的N端和C端富含脯氨酸，目前研究认为LAPTM4B-35通过影响细胞信号转导影响细胞生物学变化［3］。其中LAPTM4B-35基因与多种肿瘤发生发展及生物学行为密切相关，最近研究显示其与肿瘤的转移密切相关［4］。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一组与细胞外基质蛋白重塑过程密切相关的蛋白酶，目前有26个MMPs被发现［5］。其中MMP-9在调节肿瘤生长、血管生成和肿瘤侵袭转移方面发挥重要作用［6］。然而目前对LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌中作用及相互作用研究较少，尤其是临床标本中的应用，因此本研究探讨LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2006年1月至2011年12月在天津市南开医院和天津医科大学肿瘤医院实施胃癌根治术并具有完整临床病理资料的胃癌患者随访记录。纳入标准：1）病理诊断为胃腺癌；2）接受胃癌根治性R0切除；3）清扫淋巴结数目＞15枚；4）术前检查无腹腔、肝、肺等远处脏器转移；5）具有完整随访资料的患者。排除标准：1）术前接受新辅助放化疗；2）生存期不足1个月的患者。经筛选共纳入152例，患者术后进行病理分型，分级分期参考美国癌症联合委员会（AJCC）第7版（2010年）胃癌TNM分期。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及细胞株mRNA检测 正常胃黏膜细胞株GES-1及胃癌细胞株HGC-27、SGC7901、MGC803由天津医科大学肿瘤医院公共实验室提供；细胞系保持温度为37℃、所需环境为5%CO2和95%空气，RPMI 1640培养基及10%胎牛血清和青霉素、链霉素均购自北京索莱宝生物有限公司。本研究首先对总RNA进行提取，琼脂糖凝胶电泳检测总体RNA，浓度与纯度采用紫外分光光度计检测。以Oligo-dT（购自北京通瑞生物有限公司）为引物，参照20 μL反应体系合成cDNA第一链。引物序列为LAPTM4B-35：5'-GGAAGCAGG ACAGCCAACTT/TTATTCTCGATCTCACAACCAAC-3'；MMP-9：5'-AGGACGGCAATGCTGATG/GTGGTGGCGG TTGATGCT-3′；β-actin：5′-CCTGTGGCATCCACGAAA CT/GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。预变性95℃30s，退火30 s，扩展53.5℃30 s，40个循环，最后延伸57.5℃10 min。每个基因进行3次检测。通过PCR仪自动生成Ct（2-ΔΔCt）值。

1.2.2 免疫组织化学及阳性判定 常规对标本进行烤片、脱蜡、水化，加入柠檬酸钠缓冲液抗原修复，将3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶及5%羊血清封闭石蜡标本30 min，加用LAPTM4B-35兔抗人单克隆抗体（1∶50稀释）或MMP-9兔抗人单克隆抗体（1∶50稀释）室温孵育2 h，将石蜡标本用PBS洗涤，然后将辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG室温滴加孵育30 min，使用DAB显色，显色后用流水冲洗，然后用苏木素复染，最后用乙醇、二甲苯脱水，最后封片镜检。未加一抗者为阴性对照。

在光学显微镜200倍的视野下进行观察。阳性细胞率计分标准：视野下阳性细胞＜5%为0分，5%～24%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。着色强度：无染色0分，淡黄色染色为1分，黄色为2分，深棕黄色为3分；采取染色强度和肿瘤细胞阳性率综合评价染色指数。阳性细胞率计分乘以着色强度所得评价染色指数：≤3分为阴性，＞3分为阳性［7］。

1.2.3 随访 对胃癌术后患者定期复查，复查内容包括肿瘤标记物，必要时行胃镜检查及CT相关检查。所有患者术后进行电话随访，随访截止日期为2017年7月1日。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。胃癌细胞株和正常胃黏膜细胞株中mRNA的表达差异比较采用t检验，LAPTM4B-35和MMP-9蛋白表达与临床病理因素之间的关系采用χ2检验，单因素分析采用Ka⁃plan-Merier法，组间差异分析采用Log-rank法，将单因素有意义的因素纳入Cox回归进行多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 本组胃癌患者临床病理情况

本研究共纳入152例胃癌患者，患者临床基本病理特征：男性86例，女性66例；平均年龄59.4岁，≤60岁106例，＞60岁56例；肿瘤最大直径≤5 cm 102例，＞5 cm 50例；远端1/3胃癌59例，中1/3胃癌60例，近端1/3胃癌33例；Lauren's分型肠型107例，弥漫性45例；高中分化癌12例，低分化癌140例；淋巴结转移N分期：N0期48例、N1期28例、N2期30例、N3期46例；肿瘤浸润T分期：T1期10例、T2期4例、T3期9例、T4期129例；患者5年生存率为43.4%。

2.2 胃癌细胞株及正常胃黏膜细胞中mRNA的表达水平

LAPTM4B-35 mRNA 在 HGC-27（0.34±0.07）、SGC7901（0.29±0.09）和 MGC803（0.37±0.06）胃癌细胞株相对表达量明显高于GES-1（0.17±0.05）胃黏膜细胞株，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

MMP-9 mRNA在HGC-27（0.39±0.06）、SGC7901（0.23±0.05）和MGC803（0.32±0.07）胃癌细胞株相对表达量明显高于GES-1（0.09±0.03）胃黏膜细胞株，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 LAPTM4B-35 mRNA与MMP-9 mRNA在不同胃癌细胞株内的表达Figure 1 LAPTM4B-35 mRNA and MMP-9 mRNA expression in different gastric cancer cell lines

2.3 LAPTM4B-35和MMP-9蛋白表达与临床病理因素的相关性

免疫组织化学结果显示LAPTM4B-35和MMP-9均在细胞质中表达（图2）。本组胃癌石蜡标本中LAPTM4B-35阳性表达77例，阳性表达率为50.7%；MMP-9阳性表达56例，阳性表达率为36.8%。相关分析显示LAPTM4B-35的表达与MMP-9的表达呈正相关（r=0.027，P=0.003）。

结合临床病理因素相关分析显示Lauren's分型（P=0.027）和肿瘤浸润T分期（P=0.006）与LAPTM4B-35表达相关，发现浸润深度越深，LAPTM4B-35阳性表达越高；肿瘤大小（P=0.001）和淋巴结转移N分期（P＜0.001）与MMP-9表达密切相关，发现淋巴结转移越多，MMP-9阳性表达越高（表1）。

2.4 患者预后生存分析

预后单因素分析结果显示性别、年龄、Lauren's分型和肿瘤大小与胃癌患者预后无相关（P＞0.05），而肿瘤的部位（P=0.027）、分化程度（P=0.004）、肿瘤浸润T分期（P＜0.001）、淋巴结转移N分期（P＜0.001）、LAPTM4B-35表达（P＜0.001）和 MMP-9表达（P＜0.001）与胃癌患者预后相关。Cox多因素分析结果显示分化程度（HR=4.075，P=0.021）、淋巴结转移N分期（HR=1.413，P＜0.001）、LAPTM4B-35表达（HR=1.733，P=0.010）与MMP-9表达（HR=1.591，P=0.031）是胃癌患者独立预后因素（表2）。根据LAPTM4B-35和MMP-9表达进行预后分析发现阴性表达患者预后明显好于阳性表达患者（图3）。

根据LAPTM4B-35和MMP-9表达，将患者分为LAPTM4B-35（+）MMP-9（+）30例、LAPTM4B-35（+）MMP-9（-）47例、LAPTM4B-35（-）MMP-9（+）26例、LAPTM4B-35（-）MMP-9（-）49例，预后生存分析发现共表达阳性患者预后最差，而单独表达阳性患者之间生存无显著性差异（图4）。

图2 免疫组织化学检测LAPTM4B-35与MMP-9在胃癌组织表达（IHC×400）Figure 2 LAPTM4B-35 and MMP-9 expression in gastric cancer tissue sections(IHC×400)

表1 胃癌患者LAPTM4B-35和MMP-9表达与临床病理因素之间相关性Table 1 Relationship of LAPTM4B-35 or MMP-9 expression with clinicopathological factors

表1 胃癌患者LAPTM4B-35和MMP-9表达与临床病理因素之间相关性（续表1）Table 1 Relationship of LAPTM4B-35 or MMP-9 expression with clinicopathological factors

表2 胃癌患者预后单因素和多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of factors influencing OS

表2 胃癌患者预后单因素和多因素分析（续表2）Table 2 Univariate and multivariate analysis of factors influencing OS

图3 LAPTM4B-35与MMP-9表达与患者5年OS的关系Figure 3 Relationship of LAPTM4B-35 and MMP-9 expression with 5-year OS

图4 LAPTM4B-35和MMP-9共表达情况预后生存分析Figure 4 Prognostic survival analysis based on co-expression of LAPTM4B-35 and MMP-9

3 讨论

LAPTM4B基因定位于8q22.1，长约50 kb，共含有7个外显子和6个内含子，DNA全长为2 245个核苷酸。根据其表达产物存在4个穿膜区、有典型的溶酶体定位信号集，因此该基因被命名为溶酶体相关4次跨膜蛋白B，即LAPTM4B［8］。LAPTM4B有2种亚型，LAPTM4B-35和 LAPTM4B-24，研 究发现LAPTM4B-35过表达时抑制细胞凋亡，促进增殖、迁移及侵袭，并通过启动PI3K/AKT信号通路逆转耐药［9］。研究发现LAPTM4B-35基因多态性或过表达与肝癌、肺癌、胃癌等发病风险具有显著相关性，同时发现LAPTM4B-35高表达于乳腺癌、肺癌、胆囊癌、结肠癌、恶性胶质瘤等肿瘤中［10］。Dong等［11］发现在胶质瘤中Ⅱ级胶质瘤LAPTM4B-35表达低于Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤，推测LAPTM4B-35可能与胶质瘤发展密切相关。Kong等［12］发现在非小细胞肺癌中高表达的LAPTM4B-35基因与肿瘤的复发密切相关。这些研究表明LAPTM4B-35与肿瘤发生和淋巴结转移密切相关。本研究发现LAPTM4B-35 mRNA在胃癌细胞株中表达明显高于正常黏膜组织，进一步相关分析发现胃癌组织中LAPTM4B-35蛋白表达与Lau⁃ren's分型和肿瘤浸润T分期密切相关，推测高表达的LAPTM4B-35可能与胃癌发展密切相关。

MMP-9已在多种恶性肿瘤中被发现高表达。MMP-9主要通过降解细胞胶质蛋白和Ⅳ、Ⅴ、Ⅺ、ⅩⅥ型胶原蛋白促进肿瘤细胞的侵袭和转移［13-14］。在非小细胞肺癌患者中，发现血清中MMP-9明显较正常患者升高，Sampieri等［15］发现MMP-9在结直肠癌细胞中高表达，并且与结直肠癌的侵袭性转移密切相关。Ruokolainen等［16］发现MMP-9在头颈部鳞状细胞癌高表达，然而与临床病理因素结合，未发现其表达与临床病理因素之间无相关性。有研究表明在胃癌中MMP-9表达与淋巴结转移、浸润、远处转移及TNM分期密切相关［6］，推测MMP-9在不同肿瘤中发挥不同作用。本研究同样发现胃癌细胞株中MMP-9 mRNA表达较高，进一步发现胃癌组织中阳性MMP-9的表达与较大的肿瘤和较多的淋巴结转移密切相关，因此推测MMP-9可能在胃癌淋巴结转移发挥作用，与部分研究相一致［17］。

在预后生存方面，Cox多因素分析发现淋巴结转移、LAPTM4B-35表达和MMP-9表达是本组胃癌患者的独立预后因素，进一步分析发现LAPTM4B-35阴性表达患者和MMP-9阴性表达患者预后差于LAPTM4B-35阳性表达患者和MMP-9阳性表达患者。本研究还发现本组胃癌患者LAPTM4B-35表达和MMP-9表达呈正相关，推测LAPTM4B-35和MMP-9相互作用，共同促进胃癌的发展。根据LAPTM4B-35和MMP-9共表达进行分析，共表达阳性患者预后最差，共表达阴性预后最好，而表达一种阳性患者之间的预后比较差异无统计学意义，联合LAPTM4B-35和MMP-9可预测胃癌患者预后，通过检测LAPTM4B-35与MMP-9表达有助于鉴别高危胃癌患者，从而选择合适的治疗。

本研究尚有不足之处，如LAPTM4B-35是否为MMP-9上游基因尚未明确，以及LAPTM4B-35敲除对胃癌细胞侵袭转移的影响等需要进一步深入探讨。

综上所述，本研究发现LAPTM4B-35和MMP-9在胃癌细胞和胃癌组织中高表达，LAPTM4B-35和MMP-9表达可能与胃癌侵袭、转移和预后密切相关。

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