郑麦366α-醇溶蛋白基因的克隆及生物信息学分析

李文旭，常 阳，杨 攀，王美芳，何盛莲，吴政卿，雷振生，晁岳恩

（河南省农业科学院小麦研究所，河南郑州450002）

郑麦366α-醇溶蛋白基因的克隆及生物信息学分析

李文旭，常 阳，杨 攀，王美芳，何盛莲，吴政卿，雷振生，晁岳恩*

（河南省农业科学院小麦研究所，河南郑州450002）

为研究优质强筋小麦品种郑麦366α-醇溶蛋白的组成，应用简并引物进行PCR扩增，从郑麦366中扩增得到13条核苷酸序列，其中9条序列推导的氨基酸序列具有完整的开放阅读框。进一步分析显示，克隆的9个基因（分别命名为ZM366-1—ZM 366-9）编码的蛋白质均具有α-醇溶蛋白的典型结构特征，根据T-细胞毒性抗原表位数目和多聚谷氨酰胺区特征分别将ZM366-1、ZM 366-2定位到6A染色体，ZM 366-3、ZM366-4定位到6D染色体，ZM 366-5—ZM 366-9定位到6B染色体。蛋白质二级结构预测显示，克隆的9个α-醇溶蛋白都仅含有α-螺旋结构，其中B基因组α-醇溶蛋白的α-螺旋含量明显高于其他基因组。同源系统进化树分析表明，克隆的9个α-醇溶蛋白具有明显的基因组特异性。

小麦；α-醇溶蛋白；克隆；生物信息学

小麦醇溶蛋白和麦谷蛋白共同作用决定着面粉的加工品质，其中醇溶蛋白主要影响面团的延展性和黏性［1］。根据在酸性聚丙烯酰胺凝胶中迁移率不同，小麦醇溶蛋白分为α、β、γ和ω4个组分［2］。根据N-端序列不同，小麦醇溶蛋白又可分为α-型、γ-型、ω型，其中α-和β-醇溶蛋白在氨基酸序列上极为相似，通常统称为α-或α/β-醇溶蛋白，α-醇溶蛋白在种子内最为丰富，其含量占种子总蛋白质的15%～30%［3-4］。因此，分离小麦α-醇溶蛋白并研究其功能对于小麦优质育种和改良面粉加工品质有重要意义。研究表明，α-醇溶蛋白主要由位于第6部分同源染色体短臂上的Gli-2位点编码［5］。普通小麦中α-醇溶蛋白基因的拷贝数为25～150个，但是50%以上的基因被认为是假基因［4，6］。典型的α-醇溶蛋白包括19～20个氨基酸的信号肽和5个结构域，蛋白质间的差异主要来源于重复区和多聚谷氨酰胺区［7］。小麦α-醇溶蛋白基因的缺失或沉默会导致面筋韧性增强、延展性增加和弹性降低等［8-9］。掺粉试验结果表明，添加典型的α-醇溶蛋白能降低面筋强度，而添加含有1个半胱氨酸的α-醇溶蛋白能够增加面筋弹性，但是面筋强度的变化并不一致［10-11］。

乳糜泻症（celiac disease，CD）是患者对小麦、燕麦、大麦中的面筋蛋白产生免疫应答反应而引发的炎症［12］。小麦α-醇溶蛋白内存在多种肽段与CD诱发有关，其中T-细胞毒性抗原表位glia-α2、gliaα9、glia-a20和glia-a是已知的主要诱发因子；此外，其他多种短肽也与CD发生有关［4，13］。研究还发现，T-细胞毒性抗原表位分布可用于α-醇溶蛋白基因的基因组定位［13］。

目前，在普通小麦及其近缘种中已经克隆得到大量α-醇溶蛋白基因［14-17］，但是有关优质小麦α-醇溶蛋白的研究还不多，主要集中于郑麦004、藁城8901、中优9507［15，17］，优质小麦除已知的高低分子量优质亚基外，是否还存在优质醇溶蛋白尚不明确。为此，以优质面包专用型小麦品种郑麦366为材料，采用同源克隆的方法分离α-醇溶蛋白基因，并对分离的基因序列进行分析，以期为α-醇溶蛋白功能研究和小麦品质遗传改良奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

小麦品种郑麦366由河南省农业科学院小麦研究所选育保存，2015年播种于河南省农业科学院小麦研究所温室，种子出苗2周后备用。

1.2 基因组DNA提取和α-醇溶蛋白基因的克隆

小麦基因组DNA的提取采用CTAB法［18］，基因组DNA经过RNase处理后，将质量浓度调整到50μg/μL，备用。参考Xie等［17］的研究报道合成1对引物gliα-F（5′-ATGAAGACCTTTCTCATCCTTG-3′）和gliα-R（5′-TCAGTTRGTACCRAAGAT GCC-3′），用于扩增α-醇溶蛋白基因。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。选用TaKaRa公司的LA Taq进行PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，然后回收，纯化目的片段，随后将目的片段克隆到pMD18-T载体（TaKaRa，大连），并转化到大肠杆菌DH5α中。通过蓝白斑筛选阳性克隆，经菌落PCR、酶切验证后送上海生物工程技术服务有限公司测序。

1.3 序列分析、CD毒性肽识别和系统进化树构建

应用FGENESH在线软件进行基因结构分析和氨基酸序列预测。利用Bioedit 7.0软件将克隆的α-醇溶蛋白与郑麦004、藁城8901、中优9507的典型序列进行比对［15，17］。根据van Herpen等［13］的方法识别克隆基因所编码的4种主要的T-细胞毒性抗原表位，同时分析LGQGSFRPSQQN和LGQQQPFPPQQPYPQPQ毒性肽的分布［4］。利用Phyre 2和PSIPRED在线预测软件对α-醇溶蛋白二级结构进行预测。

在NCBI数据库中分别下载乌拉尔图小麦（Triticum urartu，AA）、拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops speltoides，BB）和粗山羊草（Aegilops tauschii，DD）的α-醇溶蛋白序列，采用MEGA 6.0软件，应用N-J法构建本研究克隆得到的α-醇溶蛋白的系统进化树，Bootstrap值设为1 000。

2 结果与分析

2.1 郑麦366α-醇溶蛋白基因的克隆及核苷酸序列分析

以郑麦366基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得长度约1 000 bp的片段（图1）。将目的片段连接到pMD18-T载体后，转化到大肠杆菌中。PCR扩增和酶切鉴定后，随机挑取30个阳性克隆进行全长测序。测序结果表明，共得到13条非重复序列，序列长度为849～903 bp。核苷酸序列比对显示，克隆得到的13条核苷酸序列与NCBI数据库中的α-醇溶蛋白同源性为91%～99%。通过FGENESH在线软件预测显示，10条序列具有完整的开放阅读框，且不存在内含子，推导的氨基酸序列长度为287～300个，其中2条序列推导的氨基酸序列完全相同，还有3条核苷酸序列分别在103、214、352 bp处出现C→T的变化，提前出现终止密码子，被认为是假基因。因此，共获得9个氨基酸序列特异性α-醇溶蛋白基因，分别命名为ZM366-1—ZM366-9。

2.2 郑麦366α-醇溶蛋白氨基酸序列和CD毒性肽分析

与已报道的郑麦004（ZM0004）、藁城8901（GC 8901）、中优9507（ZY9507）的α-醇溶蛋白进行多重序列比对（图2A）发现，郑麦366的9个α-醇溶蛋白均具有α-醇溶蛋白典型结构特征：1个信号肽、1个N-端重复区、2个特征区、2个多聚谷氨酰胺区，并且每个α-醇溶蛋白都含有6个半胱氨酸。α-醇溶蛋白间的差异主要来源于多聚谷氨酰胺区和N-端重复区。在2个多聚谷氨酰胺区，其中多聚谷氨酰胺Ⅰ区含有14～22个谷氨酰胺，多聚谷氨酰胺Ⅱ区含有7～27个谷氨酰胺；在N-端重复区，ZM366-2存在一段氨基酸序列为SLGQQQP的短肽插入，明显不同于其他α-醇溶蛋白。此外，ABD基因组来源的α-醇溶蛋白在N-端重复区、特征区等存在氨基酸位点的多态性（图2A），其多态性主要来源于ABD基因组α-醇溶蛋白基因核苷酸序列的颠换和转换（表1）。

分析CD诱发因子发现，克隆得到的郑麦366的9个α-醇溶蛋白基因中，仅ZM366-1和ZM366-2编码的蛋白质中存在LGQGSFRPSQQN毒性肽，而LGQQQPFPPQQPYPQPQ毒性肽只出现在ZM366-1编码的蛋白质中（图2A）。进一步分析（表2）显示，4种T-细胞毒性抗原表位在9个α-醇溶蛋白基因中的分布存在差异，其中ZM366-1和ZM366-2编码蛋白质中均仅含有1个T-细胞毒性抗原表位Glia-α20，它们编码蛋白质的多聚谷氨酰胺Ⅰ区谷氨酰胺数量均为19个，略高于其他基因（除ZM 366-6外），表明ZM 366-1和ZM366-2来源于6A基因组；ZM 366-5和ZM 366-6编码蛋白质均仅含有1个T-细胞毒性抗原表位Glia-α，而ZM 366-7、ZM 366-8和ZM 366-9编码蛋白质均不含有任何T-细胞毒性抗原表位，并且ZM366-5—ZM366-9的多聚谷氨酰胺Ⅱ区谷氨酰胺数量为17～27个，明显高于其他α-醇溶蛋白基因，表明ZM366-5—ZM366-9来源于6B基因组；ZM366-3和ZM 366-4编码蛋白质都含有Glia-α2、Glia-α9和Glia-α20三种T-细胞毒性抗原表位，且数量均为1，它们的多聚谷氨酰胺Ⅰ区和多聚谷氨酰胺Ⅱ区谷氨酰胺数量分别为15个和12个，介于其他α-醇溶蛋白基因之间，表明它们来源于6D基因组。

利用Phyre 2在线预测软件对推导的α-醇溶蛋白进行二级结构预测发现，克隆得到的9个α-醇溶蛋白基因编码蛋白质都仅含有α-螺旋，其含量介于21%～48%，其中B基因组来源的α-醇溶蛋白α-螺旋含量明显高于其他基因组（表2）。采用PSIPRED在线软件分析上述α-醇溶蛋白同样只检测到α-螺旋。进一步分析的结果显示，α-螺旋在α-醇溶蛋白中的分布相对保守，主要出现在特征区和多聚谷氨酰胺Ⅱ区，其中B基因组α-醇溶蛋白的α-螺旋更为连续，同时其多聚谷氨酰胺Ⅱ区谷氨酰胺数量高于其他基因组，所以其α-螺旋长度更长（图2A、2B），这也解释了B基因组α-醇溶蛋白的α-螺旋含量高于其他基因组的原因。

2.3 郑麦366α-醇溶蛋白的系统进化分析

为明确克隆得到的郑麦366的α-醇溶蛋白基因与普通小麦祖先种二倍体小麦的亲缘关系，在NCBI数据库中下载得到45个乌拉尔图小麦、18个拟斯卑尔脱山羊草和49个粗山羊草α-醇溶蛋白序列。应用MEGA 6.0软件，采用N-J法构建它们与本研究克隆得到的9个郑麦366α-醇溶蛋白序列的系统进化树。图3显示，所有的α-醇溶蛋白可分为3类，GroupⅠ主要包含乌拉尔图小麦的α-醇溶蛋白，此外，还含有5个粗山羊草和2个拟斯卑尔脱山羊草α-醇溶蛋白；GroupⅡ主要包含粗山羊草的α-醇溶蛋白，同时还包括6个拟斯卑尔脱山羊草α-醇溶蛋白，GroupⅠ和GroupⅡ可以进一步聚为一类，这表明两者的亲缘关系更近。GroupⅢ含有10个拟斯卑尔脱山羊草、10个粗山羊草和2个乌拉尔图小麦α-醇溶蛋白，组内拟斯卑尔脱山羊草和粗山羊草进一步聚为多个亚类，这表明它们有紧密的遗传进化关系。在3类中都存在拟斯卑尔脱山羊草，这表明其在进化过程中存在着广泛的变异。ZM 366 -1、ZM366-2和ZM366-3、ZM366-4分别聚类于GroupⅠ和GroupⅡ组，具有明显的基因组来源特异性；而ZM 366-5、ZM 366-6、ZM 366-7、ZM366-8、ZM366-9分布于GroupⅢ组，与拟斯卑尔脱山羊草聚于1个亚组。

3 讨论

研究表明，α-醇溶蛋白中存在的T-细胞毒性抗原表位是诱发CD的重要原因。本研究克隆的来源于A、B、D基因组的α-醇溶蛋白分别含有1、0～1、3个T-细胞毒性抗原表位。分析藁城8901、中优9507、郑麦004和中国春及其代换系的α-醇溶蛋白发现，A、B、D基因组的α-醇溶蛋白分别含2、0、1～5个T-细胞毒性抗原表位［15-17］。van Herpen等［13］研究发现，A、B、D基因组的祖先种二倍体小麦分别含0～2、0～1、1～5个T-细胞毒性抗原表位。以上研究表明，α-醇溶蛋白的T-细胞毒性抗原表位在品种间存在多态性。因此，可以通过传统遗传育种或人工合成小麦等方式优化小麦ABD基因组内α-醇溶蛋白的组合，培育低或者缺失T-细胞毒性抗原表位的优质小麦，从而降低CD发生风险。

Masci等［19］研究低分子量麦谷蛋白的结构发现，重复区中高比例的谷氨酰胺与面团的延展性有关。本研究克隆的郑麦366的α-醇溶蛋白多聚谷氨酰胺区谷氨酰胺数量介于7～27个，与前人研究结果类似［17］。然而，有报道显示，二倍体小麦α-醇溶蛋白的多聚谷氨酰胺Ⅰ区谷氨酰胺的数量可以达到66个［15］，这可能是由于发生不等交换或者基因转换所致［20］。同时，研究还发现，郑麦366 B基因组来源的α-醇溶蛋白多聚谷氨酰胺Ⅱ区谷氨酰胺是连续的，而藁城8901和中优9507 B基因组来源的α-醇溶蛋白多聚谷氨酰胺Ⅱ区存在亮氨酸、谷氨酸等的替换，这可能是由于编码谷氨酰胺的密码子CAA/CAG发生突变导致。研究发现，二倍体小麦的α-醇溶蛋白多聚谷氨酰胺区存在更为广泛的氨基酸替换现象［21］。多聚谷氨酰胺区谷氨酰胺的氨基酸替换和数量变化对α-醇溶蛋白的结构、功能以及小麦加工品质的影响目前还未见报道。利用X射线晶体成像技术分析富含谷氨酰胺的亨廷顿蛋白发现，多聚谷氨酰胺受蛋白质侧翼序列构象、温度和离子等因素影响会形成α-螺旋、无规则卷曲和扩展环等不同的构象［22］。此外，有报道称富含多聚谷氨酰胺的蛋白质容易聚集在一起［23］，而聚集状态的多聚谷氨酰胺通常呈β-折叠结构［24］，这表明小麦α-醇溶蛋白的多聚谷氨酰胺区可能存在复杂的构象变化。

由于小麦醇溶蛋白结构的复杂性和无序性，对其结构的了解还十分有限。通过小角度X射线散射对小麦醇溶蛋白进行研究发现，它们为椭圆形结构［25］。采用傅里叶变换红外光谱法分析显示，正常条件下小麦醇溶蛋白的二级结构富含α-螺旋，但是在高温和添加化学伴侣甘油的条件下其α-螺旋和β-折叠数量显著增加；通过小角度X射线散射分析表明，其四级结构为六方密堆积结构［26］。Xie等［17］应用PSIPRED软件预测普通小麦和二倍体小麦α-醇溶蛋白的二级结构，结果显示，α-螺旋和β-折叠普遍存在于α-醇溶蛋白中，其含量分别为16.5%～29.4%和3.4%～9.7%。Li等［15］同样采用PSIPRED软件分析198个α-醇溶蛋白发现，约68%的α-醇溶蛋白同时含有α-螺旋和β-折叠，且β-折叠的数量为1～2个，低于Xie等［17］的研究结果（2～8个），其他α-醇溶蛋白仅含有α-螺旋。本研究利用Phyre 2和PSIPRED在线预测软件对α-醇溶蛋白进行二级结构分析，得出与Li等［15］类似的结论，克隆的9个α-醇溶蛋白都仅含有α-螺旋，其含量介于30%～48%。对α-醇溶蛋白结构预测结果不同的可能原因一方面是软件程序算法不同，另一方面是由于α-醇溶蛋白难以获得晶体结构，因此，仅能根据其他蛋白质或肽段结构进行预测，导致结果可信度不高。

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Cloning and Bioinformatic Analysis ofα-gliadin Genes in Zhengmai366

LIWenxu，CHANG Yang，YANG Pan，WANG Meifang，HE Shenglian，WU Zhengqing，LEI Zhensheng，CHAO Yueen*
（Institute ofWheat Research，Henan Academ y of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

To reveal the composition ofα-gliadin protein in high quality and strong gluten wheat variety Zhengmai 366，the PCR amp lification were app lied to cloneα-gliadin genes in Zhengmai 366 with degenerate primers.In total，13 nucleotide sequences were amp lified，while the deduced amino acid sequences of nine encoded comp lete open reading frames.Further analysis showed that the cloned genes（named as ZM 366-1—ZM366-9 respectively）had the typical characteristics ofα-gliadin.According to the number of T cell stimulatory toxic epitopes and the characteristics of polyglutamine domain，ZM366-1 and ZM366-2，ZM 366-3 and ZM 366-4 and ZM366-5—ZM 366-9 were localized to the 6A，6D and 6B chromosome respectively.Secondary structure prediction showed that all the nineα-gliadin cloned in the present study only containedα-helix structure，and the content ofα-helix was significantly higher inα-gliadin of B genome than that of others.Phylogenetic tree analysis showed that the clonedα-gliadin of present study had obvious genomic specificity.

wheat；α-gliadin；cloning；bioinformatic analysis

S512

A

1004-3268（2017）01-0013-07

2016-09-28

国家自然科学基金青年基金项目（31501382）；河南省农业科学院优秀青年基金项目（2013YQ02）；河南省农业科学院自主创新基金项目（2016ZC07）

李文旭（1982-），男，内蒙古赤峰人，助理研究员，博士，主要从事小麦遗传育种研究。E-mail：tinbingye@163.com

*通讯作者：晁岳恩（1974-），男，河南濮阳人，副研究员，博士，主要从事小麦遗传育种研究。E-mail：nkychaoyueen@153.com