KingFisher核酸提取仪在疑难检材中的应用

林德胜 练惠辉 黄建春

KingFisher核酸提取仪在疑难检材中的应用

林德胜 练惠辉 黄建春

福建省公安厅刑事技术总队

：探讨KingFisher核酸提取仪的应用价值。：通过对不同检材的提取纯化，对比KingFisher核酸提取仪和4种提取纯化方法的提取效果。：KingFisher具有高效的纯化效果。

法医物证 提取纯化 KingFisher

DNA在案件侦破过程中发挥的作用越来越重要。近年来，检材量逐年上升，特别是以接触性检材为主的疑难物证数量呈爆发态势增长。传统的手工提取方法工作量大、操作复杂、易污染、容易受技术手法和操作经验的影响，而采用自动化核酸提取仪可以提供一种稳定的实验方案，同时减轻实验人员的负担。

本研究采用Thermo公司的KingFisher核酸提取仪，对比几种常见的DNA提取纯化方法，初步评估KingFisher核酸提取仪的应用效果。

1 材料与方法

1.1 实验样本

测试样本：用脱落细胞粘取器粘取指纹9个。

案件样本：案件中各类检材37个，其中鞋帽手套22个，刀柄2把，烟头13个。

建库样本：陈旧疑难血样6份。

1.2 仪器和试剂

1.2.1仪器

KingFisher核酸提取仪（Thermo公司，美国）、EZ1快速核酸提取仪（QIAGEN公司，德国）、9700扩增仪（AB公司，美国）、ABI-3500XL遗传分析仪（AB公司，美国）。

1.2.2试剂

ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒（长春博坤公司，中国）、EZ1®DNA Investigator试剂盒（QIAGEN，德国）、MagAttract®M48 DNA Manual试剂盒（QIAGEN，德国），QIAquick®PCR Purification试剂盒（QIAGEN，德国），Identifiler®Plus试剂盒（AB公司，美国），ID-Direct试剂盒（AB公司，美国）。

1.3 方法

1.3.1样本处理

测试样本：将粘取好样本的脱落细胞粘取器膜片（规格1cm×1cm）用剪刀平均剪成两片，分别用KingFisher核酸提取仪和EZ1核酸提取仪提取纯化。

案件样本：鞋帽手套用脱落细胞粘取器粘取，分别用KingFisher核酸提取仪和硅胶膜吸附法提取纯化；刀柄用干湿两步法擦拭，烟头直接剪取，分别用KingFisher核酸提取仪和M48法提取纯化。

建库样本：陈旧疑难血样分别用KingFisher核酸提取仪和ID-Direct直接扩增。

1.3.2样本DNA提取纯化

KingFisher法：加入240μL消化液ML、20μL浓度为10mg/mL的PK溶液，65℃消化30min，之后12000r/min ，离心3min，将离心后的上清液加入到试剂条中，然后按照试剂盒说明书标准程序进行，模板DNA洗脱体积为40μL。

EZ1法：加入190μLG2，20μL浓度为10mg/mL的PK溶液，56℃裂解30min，然后按试剂盒说明书标准程序进行，模板DNA洗脱体积为40μL。

M48法：加入190μLG2，20μL浓度为10mg/mL的PK溶液，56℃裂解120min，然后按试剂盒说明书标准程序进行，模板DNA洗脱体积为40μL。

硅胶膜吸附法：加入200μL裂解液，20μL浓度为10mg/mL的PK溶液，56℃裂解120min，然后按试剂盒说明书标准程序进行，模板DNA洗脱体积为40μL。

1.3.3 DNA扩增

提取得到DNA模板用Identifiler®Plus试剂盒进行复合扩增，反应总体积为10μL。反应条件：预变性95℃10min；扩增阶段94℃ 20s，59℃ 3min，共29个循环；延伸阶段60℃ 10min；保存条件4℃。

1.3.4电泳分析STR分型

PCR产物在ABI-3500XL遗传分析仪上进行毛细管电泳，应用GeneMapper@ID-Xv1.5软件对电泳数据进行分析。

2 结果

以获得16个完整清晰的基因座分型为成功检出，实验的结果见表1、图1～图4。

表1 DNA检验结果对比表

在KingFisher与EZ1的比较中发现，KingFisher法获得9个完整的个体STR分型，EZ1法获得6个完整的个体STR分型，有3个检材出现部分位点丢失的情况，而且KingFisher组的检验结果RFU值普遍比EZ1组高。

图1 KingFisher法提取指纹3

图2 EZ1法提取指纹3

对于靴帽、手套、工具、陈旧烟头等检材，KingFisher法与M48和硅胶膜吸附法获得相同的结果，直扩未出的血样用KingFisher也获得了完整分型。

图3 KingFisher法提取刀柄上斑迹

图4 硅胶膜吸附法提取刀柄上斑迹

3 讨论

目前疑难检材DNA检验的方法主要是硅珠法和磁珠法，其原理是利用DNA在一定条件下能与硅（磁）珠结合，可以进行洗涤纯化，再通过改变条件，从硅（磁）珠上收集DNA。影响提取效率的因素主要有硅（磁）珠结合DNA的量，以及DNA在洗涤过程中损失程度。

市面上的大部分DNA自动化纯化仪也主要根据该原理进行设计，区别在于优化的步骤不同。充分的硅（磁）珠量和结合时间可以获取更多的DNA，洗涤工艺次数的优化，可以有效解决除杂程度和DNA损失的矛盾。

对比KingFisher提取仪和几种纯化方法的纯化效果，KingFisher提取仪的纯化效果与手工的M48和硅胶膜吸附法相当，优于EZ1提取纯化仪。KingFisher提取仪延长了磁珠的结合时间，改变以往转移液体的模式，采用转移磁珠的方式，同时确保在磁头转移时没有任何挂液现象，最大限度减少洗涤过程的DNA损失，有效富集DNA。时间上，KingFisher仪器单次运行最大通量为24，样本前期消化时间是30min，仪器后期运行时间是53min，以做24个样本算，加上手工操作，整体时间约2h，具有较高的纯化效率。

综上所述，KingFisher纯化提取仪具有高通量、操作简单、纯化效果好的特点，可以有效解决脱落细胞提取纯化问题，适合应用于实际案件中各类检材的检验鉴定。

[1] 黄建春, 王澍, 林德胜, 等. 光滑载体上人体脱落细胞的DNA检验[J]. 海峡科学, 2014（10）：63-65.

[2] 吴薇薇，郑小婷, 等. EZ1方法在疑难生物检材STR分型中的应用[M]//胡兰. 法医遗传学进展与应用. 北京: 群众出版社, 2008：185-187.

[3] 姚建，贾东涛, 张玉红, 等. 检材量对硅珠法提取脱落细胞DNA的影响[J]. 中国法医学杂志, 2009, 24（5）：333-334.

[4] 郑小婷，徐念来. 硅珠法提取生物检材DNA的影响因素[J]. 法医学杂志, 2016, 32（1）：63-64.