应用M48磁珠试剂盒提取牙齿DNA

程 冲 陈启鸣



应用M48磁珠试剂盒提取牙齿DNA

程 冲 陈启鸣

泉州市公安局刑侦支队

：应用M48磁珠试剂盒提取牙齿DNA，并评价其应用价值。：对实验室日常受理的6例牙齿，分别采用有关文献提出的QIAquick®PCR纯化试剂盒方法和M48磁珠试剂盒提取牙齿DNA。：6例牙齿采用两种方法检出结果一致，但是M48磁珠试剂盒提取牙齿DNA过程较简单、时间短。结论：M48磁珠试剂盒可以应用于牙齿DNA提取，并能大大减少实验人员工作量。

法医物证 牙齿 DNA提取

牙齿DNA含量较骨骼少，但是牙齿外层由牙釉质和牙本质包裹，能够抵抗外界环境的影响破坏，使得DNA不易被降解，而且牙齿易于提取、包装。因此，在一些白骨化案件中，牙齿的DNA检验经常用于尸源认定。笔者采用M48磁珠试剂盒提取牙齿DNA，获得了较好的结果，报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本

本实验室日常受理的牙齿6份。

1.2 仪器和试剂

9700型扩增仪（AB公司）；3130XL型测序仪（AB公司）；M48磁珠（Qiagen公司）；Identifiler Plus试剂盒（AB公司）；骨骼孵育液（Promega公司）；EDTA缓冲液（Promega公司）；QIAquick®PCR纯化试剂盒（Qiagen公司）。

1.3 方法

1.3.1牙齿DNA的提取

（1）取牙齿1颗用清水洗净表面，用手术刀片刮去牙齿表层及污垢物，再用无水乙醇泡洗1次，去除残余的水份，用滤纸拭干。将牙齿放入砸牙器中用锤子砸成粉末，取100mg左右牙粉置于1.5mL离心管中。

（2）加入300μL骨骼孵育液、500μL EDTA缓冲液和20μL 20mg/mL PK，20μL 1 mol/ LDTT，56℃孵育6h以上。

（3）离心管快速离心后，吸取上清液600μL至15mL 离心管内，加入M48磁珠试剂盒MTL 2mL，磁珠30μL。

（4）将15mL离心管放至翻转摇匀仪摇匀15min。

（5）将15mL离心管紧贴磁力架，颠倒2次，确保磁珠吸附在磁力架一侧，小心打开盖子，倒去吸附液。

（6）15mL离心管加入100μL无水乙醇（消泡）、800μL MW1，振荡5s，小心将所有液体倒入1.5mL离心管中，磁力架吸弃液体，再用80%乙醇洗涤3次，打开盖子，65℃干燥5min。

（7）将30μL 纯水加入1.5mL离心管，盖上盖子，振荡，65℃孵育10min，13000rpm离心1min，收集上清液4℃保存备用。

另取牙粉100mg按照文献[1]中QIAquick®PCR纯化试剂盒方法提取牙齿DNA，4℃保存备用。

1.3.2 DNA扩增及产物检测

采用Identifiler Plus试剂盒在9700型扩增仪进行PCR扩增，扩增体系为10μL，DNA模板为1μL，扩增参数参照Identifiler Plus试剂盒操作手册。取上述PCR扩增产物经3130XL型测序仪电泳，结果用GeneMapper ID v3.2软件进行分析，获得等位基因分型图谱。

2 结果

2.1 M48磁珠试剂盒法与文献[1]中QIAquick® PCR纯化试剂盒方法结果比较

本文中，6例牙齿经不同提取方法检验均全部得出了一致的检验结果。两种方法分别采用Qiagen公司生产的硅膜法、磁珠法提取纯化DNA，比较不同提取方法的检验结果，M48磁珠试剂盒提取牙齿DNA操作简单快捷，纯化提取耗时30min左右，且大部分为磁珠吸附时间，人工干预少，较文献[1]中QIAquick®PCR纯化试剂盒方法节省时间，且文献[1]中牙齿提取方法由于牙齿消化后需要纯化的体系较大，牙齿消化液与PBI溶液要按体积比1:5混匀，一般混合液能达到3mL左右，需多次离心才能过滤完全部混合液，而M48磁珠方法只需1次吸附就能转换为1.5mL小离心管，在理论上减少了交叉污染的可能。同时，经检验结果对比发现，两种方法提取牙齿DNA在峰高、平衡性方面无显著差异。

2.2 案例检验应用

2016年10月26日，泉州市某水库发现一具白骨化尸体，送检牙齿2颗。牙齿采用本文方法提取DNA，并进行STR分型检验，结果成功获得STR分型（图1），为本案尸源认定提供了重要依据。

图1 牙齿STR分型

3 讨论

M48磁珠试剂盒法提取牙齿DNA的优势有：（1）检材需求量少，仅需100mg牙粉即可满足检验需求。（2）牙粉无需单独脱钙处理。（3）牙粉消化液利用磁珠吸附原理，操作简便，节约时间。（4）离心次数少，减少交叉污染。实验结果显示，两种方法检出率一致，但M48磁珠试剂盒法在操作过程更具有优势。

综上所述，M48磁珠试剂盒提取牙齿DNA操作简单，无需特殊仪器，成功率高，提取成本低廉，能满足实际检案的需求。

[1]凃政,刘志芳,陈松,等.牙齿的DNA提取及STR分型研究[J].刑事技术, 2007,196 (5): 9-11.