罗非鱼无乳链球菌传播途径与逃避宿主免疫防御策略

黎 源，王 蓓，汪志文，蔡小辉，汤菊芬，鲁义善，简纪常

（广东海洋大学水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江 524088）

罗非鱼无乳链球菌传播途径与逃避宿主免疫防御策略

黎 源，王 蓓，汪志文，蔡小辉，汤菊芬，鲁义善，简纪常

（广东海洋大学水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江 524088）

罗非鱼是我国重要的养殖鱼类之一，近年来频繁暴发的链球菌病严重影响了我国罗非鱼养殖业的健康发展。无乳链球菌是罗非鱼链球菌病的主要病原之一，阐明其感染机制和免疫逃避机制，对预防与治疗该病至关重要。对鱼源无乳链球菌的侵染途径、肠道的定植策略以及逃避宿主免疫监视机制等方面的研究成果进行综述，为深入研究无乳链球菌与宿主之间的相互作用提供参考，为罗非鱼链球菌病的综合防控奠定理论基础。

罗非鱼；无乳链球菌；传播途径；肠道定植；免疫逃避

我国是世界上最大的罗非鱼养殖生产国和出口贸易国，在目前高密度集约化养殖过程中，罗非鱼链球菌病时有发生，罗非鱼链球菌病的死亡率可达70%［1］，严重阻碍了罗非鱼养殖业的发展。罗非鱼链球菌病的病原菌主要是无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和海豚链球菌（Streptococcus iniae）［2］，其中无乳链球菌是一种人畜共患的革兰氏阳性菌，也是罗非鱼链球菌病中最常见的致病菌。感染无乳链球菌的罗非鱼，体表症状表现为眼球突出、眼眶充血，腹部膨大，肛门红肿，采食减少或绝食，翻转和转圈游动［3］。组织病理学表现为鳃充血，肾脏受损、肿大、白细胞浸润，肝脏颗粒变性，肠道粘膜上皮变性、坏死、脱落、固有膜上炎性白细胞浸润，眼睛脉络膜和眶骨膜组织炎性坏死等［4-5］。

哺乳动物的肠道免疫系统包括肠上皮细胞（IEC）、肠上皮内淋巴细胞（IIEL）、固有层淋巴细胞（LPL）、派伊氏结（PP）、肠系膜相关淋巴结等肠道淋巴组织。在鱼类肠道中，没有发现派伊氏结、肠系膜相关淋巴结，因而鱼类肠相关淋巴组织（GALT）较低级，相比于高等的哺乳动物，鱼类肠道中的免疫细胞更为分散，其中大量的白细胞分布在固有层和肠上皮细胞［6-7］，包括许多淋巴细胞，如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞，目前来看，鱼类的肠道免疫以非特异性免疫和体液免疫为主。

病原、宿主与环境之间的平衡关系决定疾病的发生，了解链球菌感染与传播途径，可以更深入认识罗非鱼、链球菌和环境之间的关系。基于现有对无乳链球菌传播途径、肠道定植策略以及免疫逃避机制的研究，无乳链球菌对罗非鱼的致病机理可能与人源无乳链球菌的机制有相似之处，即致病机理分为3个阶段：定植于盲肠或小肠内→穿越小肠上皮细胞→逃避宿主免疫防御。通过了解鱼源无乳链球菌传播途径，对于罗非鱼链球菌病的预防具有重要的指导意义，探讨鱼源无乳链球菌的宿主免疫逃避机制，将为今后链球菌病疫苗以及药物开发研究奠定基础。

1 无乳链球菌传播途径

Hernandez等［8］与 Jim é nez等［9］研究表明，无乳链球菌仅能在20 g以上的红罗非鱼中检测到，即使亲本感染链球菌，在其后代幼鱼也检测不到无乳链球菌，因此无乳链球菌主要在个体与个体之间呈水平传播。

大多数对于鱼源无乳链球菌致病机理的研究都是基于腹腔注射的感染模式，对于链球菌自然感染途径的报道还很少。Syuhaidah等［10］通过腹腔注射、浸泡、划伤浸泡3种方式，罗非鱼均有感染症状出现。Soto等［11］发现用链球菌腹腔注射、肌肉注射、口服感染和浸泡4种方式感染罗非鱼，仅腹腔注射和肌肉注射会引起死亡。Bromage等［12］研究表明，海豚链球菌可通过口服途径进入尖吻鲈鱼体内引起次急性感染，并且外表皮的损伤并没有促进海豚链球菌的侵染能力。Iregui等［13］发现通过口服感染仅在低溶解氧和高温条件下，罗非鱼才会出现感染症状，值得注意的是，经过浸泡途径感染的鱼体皮肤上不能检测到无乳链球菌，但浸泡1 h后在感染鱼的胃和肠上皮中却能检测到无乳链球菌；对罗非鱼灌胃感染链球菌后，30 min无乳链球菌就已经到达胃部，1 h后观察到罗非鱼肠道和肠腔内分泌黏液增加，并且有大量的细菌存在于胃肠道分泌的黏液物质中，2 h后大量聚集在肠上皮，这表明无乳链球菌可在胃肠道管腔内繁殖，并在黏膜上皮定植。

在实际的养殖环境下，高浓度的菌液环境难以实现，链球菌通过口腔进入罗非鱼胃和肠道，可能是自然条件下感染罗非鱼的主要传播途径。Nguyen等［14］从患病鱼养殖水体中可以检测到链球菌，认为链球菌可以通过粪-口途径传染。食用被感染病鱼可作为链球菌传播途径之一，Kim等［15］发现投食受感染的杂鱼可引起牙鲆（Paralichthys olivaceus）链球菌病暴发，Shoemaker等［16］提出同类相食感染鱼也是链球菌在尼罗罗非鱼中传播的主要原因。从无乳链球菌生物学特性来看，无乳链球菌无鞭毛，无运动能力，在自然水体中会沉底，在碎屑中富集，罗非鱼是分布于水体底层的杂食性鱼类，食性广并且贪吃，因此在自然环境下无乳链球菌更易通过口腔进入罗非鱼的胃肠道。

2 无乳链球菌在罗非鱼肠道定植策略

2.1 无乳链球菌在强酸环境下的生存策略

早期对罗非鱼鱼胃肠道的研究发现，罗非鱼胃酸pH值随摄食活动变化幅度很大［17］，在摄食情况下比其他鱼类低，甚至低至1.4［18］，这样的胃部强酸环境有利于对藻类的消化，这既是罗非鱼为了适应杂食食性所进化而来的特殊胃部环境，也是罗非鱼高生长率的重要原因［19］。在空腹情况下，罗非鱼胃酸pH值可以上升到6［17］，有利于无乳链球菌的生长。值得注意的是，罗非鱼的摄食受到光照和温度的影响，罗非鱼在夜间停止摄食，并在天亮后逐渐恢复摄食。郭恩彦等［20］研究表明，吉富罗非鱼在水温超过32℃的情况下，其摄食能力会受到较大影响而下降。因此在夜间或者高温条件下，罗非鱼的食欲下降，摄食少而导致胃部pH值升高，使得无乳链球菌更易侵染其胃肠道。

无乳链球菌躲避胃部酸性环境的机制目前还不清楚，对人源无乳链球菌的研究表明，无乳链球菌在pH值低于4.3的体外培养环境下不能生长，并且细菌数量会在数小时内衰减，衰减速度随环境pH值降低而加快［21-23］，说明在体外实验条件下，无乳链球菌并不能直接在强酸环境下生存。因此无乳链球菌是如何通过酸化的胃部环境，这还需要更多的实验去验证。

2.2 无乳链球菌耐酸分子机制

无乳链球菌可能通过某种机制逃逸胃酸环境，如其他链球菌上观察到的“耐酸受反应”（Acid tolerance response ，ATR）［24］。现有的研究表明，低pH条件能促进无乳链球菌的黏附作用以及生物膜的形成［21］。Glaser等［25］通过比较不同链球菌的基因组发现，无乳链球菌转录调节子多达107个，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）为14个，化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）为13个，说明无乳链球菌具有更为强大的环境适应能力。

研究表明，CsrS/CsrR双组分系统是无乳链球菌重要的pH感受器，酸性环境能够激活无乳链球菌的CsrS/CsrR双组分调控系统，减少毒力基因的表达［26］，同时上调多个黏附因子，从而提高无乳链球菌的黏附能力［27］。当pH上升的时候，CsrS/CsrR双组分调控系统通过转移磷酸基团，激活CovR的D53残基，CovS减少磷酸化，引导β-溶血素（β-H/C）等毒力基因的表达。反之，当无乳链球菌进入酸性环境时或者抑制CovS/R双组分系统时，相关毒力基因的表达会减少［28］，从而有效避免鱼体的免疫监视；与此同时，CovR/S还会调控其他双组份系统，如RgfA/RgfC双组分系统。RgfA/RgfC双组分系统在转录水平上调控FbsB与FbsA基因，进而调控相关蛋白表达，其中FbsA参与细胞黏附，而FbsB与侵染有关，它们都可以结合粘膜固有纤维或可溶性纤维［29］，提高无乳链球菌的黏附能力［28］。

荚膜是无乳链球菌最重要的毒力因子，其表达受到环境因子的调控［30］，但不受CovS/R双组分系统的调控。荚膜主要参与链球菌逃避宿主免疫，其调控区域分为3个部分［31］，位于前端的是CpsA-D，不参与夹膜多糖的直接合成，却是主要的夹膜调控区；CpsE-L位于该区域中部，决定血清型并编码糖基转移酶和聚合酶；NeuA-D位于操纵子区域的末端，编码合成唾液酸的酶。较低pH环境会抑制荚膜合成，缺失荚膜基因后会显著地增加无乳链球菌的黏附能力［30，32］。CpsA［33］或CpsD［32］基因的缺失，都会让无乳链球菌的荚膜明显减少，并且随着荚膜的减少，无乳链球菌链长延长，该现象在Cai等［34］的实验里也被观察到。荚膜的表达与生物膜形成可能呈负相关的关系。酸性环境下，无乳链球菌通过调控抑制荚膜的表达，延长无乳链球菌的链长，促进生物膜的形成［35］。然而生物膜与链球菌在鱼体的持续存活密不可分，细菌能够在组织的表面形成大的菌落，与多糖聚合体、蛋白、核酸及脂类交织成网，以此抵御不良环境和宿主免疫，同时提高侵染和黏附能力［36］。

在低pH值的环境下，无乳链球菌将更多的资源用于提高其黏附能力和环境适应能力，抑制其毒力基因的表达，这样的机制在无乳链球菌感染罗非鱼肠道过程中起着重要作用，一方面可以有利于无乳链球菌适应胃肠道环境，更为迅速地定植，另一方面，在感染初期抑制自身毒力基因的表达，可以有效降低宿主的免疫监视。

3 无乳链球菌逃避宿主免疫防御策略

3.1 无乳链球菌逃避鱼体肠道体液免疫

已有研究表明，Ig+细胞在多种鱼类的肠粘膜中均有发现，其中免疫球蛋白是调理吞噬作用的先决条件，在罗非鱼中发现的免疫球蛋白有 IgM、IgD［37］和 IgZ/T［38］，其中参与肠道粘膜免疫的有IgM和IgZ/T［37］。鱼类IgM分子以五聚体的形式存在，不能穿过血管壁，在巨噬细胞以及补体的协同作用下，IgM发挥着杀菌、溶菌、激活补体促进吞噬等作用，其杀菌和中和病毒的能力显著高于IgG。Zhang等［39］证实了虹鳟的IgT与抗寄生虫的粘膜免疫相关，发现虹鳟IgT的作用机制与人类IgA相似，IgA在效应的部位分泌，通过与多聚免疫球蛋白受体（pIgR）结合，然后转移到肠腔或肝胆汁中。通过免疫印迹、免疫共沉淀等技术发现，多数鱼类肠道上的细菌都可以与IgZ/IgT相结合，在肠道中结合细菌从而阻止细菌对机体的侵染。

A族链球菌在哺乳动物中通过产生G蛋白，与Ig分子的Fc区域结合，Fc区域的封闭会抑制补体和调理素的激活，从而避免宿主主要的防御机制［40］。Barnes等［41］通过 Westernblot发现在鳟鱼血清中生长的海豚链球菌，也产生一种C蛋白结合鳟鱼血清的Ig分子，因此，无乳链球菌可能也存在类似机制，产生某种蛋白封闭鱼类的Ig分子，避开体液免疫，但还需要进一步验证。

3.2 无乳链球菌逃避吞噬作用

3.2.1 抗吞噬作用 吞噬细胞作为鱼类肠道主要的非特异性免疫细胞，不仅可以快速清除入侵的病原，也作为重要的抗原呈递细胞（APC），这种生物体最古老的非特异性免疫机制，在以先天性免疫为主的鱼类免疫中起着重要作用。鱼类吞噬细胞主要包括巨噬细胞和粒细胞，粒细胞主要为中性粒细胞和嗜酸性粒细胞［42］，通过炎症部位趋化因子的介导可以迅速富集。吞噬作用可以分成3个阶段：吞噬细胞通过识别抗体的Fc段找到病原体、病原被内吞形成吞噬体，吞噬体内病原微生物降解。激活的吞噬细胞释放介导炎症反应的细胞因子如IL-1β、干扰素、TNF-α、TGF-β、趋化因子等，引起机体的免疫应答反应。将罗非鱼不同组织分离的巨噬细胞与D-半乳糖、D-葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖孵育，其结合细菌的能力被显著抑制［43］，表明罗非鱼巨噬细胞具有凝集素样受体，可以参与病原辨别，而且补体作为鱼类吞噬细胞吞噬作用重要的调理因子，也起着至关重要的作用［44］。

无乳链球菌抗吞噬作用离不开表面的荚膜多糖。无乳链球菌外的荚膜多糖（Capsule）由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、乙酰葡萄糖胺和唾液酸等构成，其中荚膜中的唾液酸与哺乳动物细胞表面广泛分布的糖表位相似，分子拟态的唾液酸可以与白细胞免疫球蛋白凝集素结合，竞争性抑制宿主细胞表面的补体C3激活［45-46］。此外，无乳链球菌还会介导补体失活，如C5α肽酶介导蛋白水解［47］，免疫球蛋白细菌黏附素抑制因子BibA降低补体结合［48］，H因子加剧补体失活［49］，CpsA会快速降解中性粒细胞激活所需的CXC家族趋化因子，如生长相关的癌基因-γ（GRO-γ）、中性粒细胞趋化蛋白-2（NAP-2）、粒细胞趋化蛋白 -2（GCP-2）［50］等。通过凝集素结合实验表明，具有完整荚膜多糖的无乳链球菌会导致N-乙酰氨基葡萄糖（PNG）唾液酸化［30］，罗非鱼肽聚糖识别蛋白（PGRP-SC2）在肠道中高表达，并通过氨酰酶活性剪切PNG实现免疫调节［51］，在短吻舌鳎中PGRP-SC2可以结合并凝集细菌，增强宿主巨噬细胞对细菌的吞噬作用［52］，无乳链球菌有可能通过该唾液酸化PNG的方式躲避吞噬作用。

3.2.2 抵御吞噬体环境 无乳链球菌可以在巨噬细胞内存活已经被证实［53-55］。通常病原被吞噬后，细菌进入吞噬体内，细胞内胞质颗粒和囊泡环绕吞噬体并与之融合，把内含物释放到病原颗粒四周腔隙内，形成一个成熟的吞噬溶酶体，杀伤机理包括氧依赖和非氧依赖两种类型。

氧依赖型吞噬机制通过吞噬细胞的呼吸爆发作用产生氧自由基和氮自由基。无乳链球菌利用 BiaA［48］、β-H/C［56］、超氧化物歧化酶（SodA）［57］、CiaR［58］和其他未知因子抵御宿主产生的活性氧，并通过CodY介导的arcABC操纵子，调节精氨酸代谢［59］，抵抗诱导型一氧化氮合酶（iNOS）介导产生的一氧化氮。

非氧依赖吞噬机制，吞噬体内具有低pH值、营养物质匮乏环境［60］，与此同时，吞噬体内胞质颗粒和囊泡含有各种水解酶，如蛋白酶、核酸酶、磷酸酶、酯酶和脂肪酶以及抗菌肽，可以分解杀灭病原。无乳链球菌对低pH环境的适应，前面已经阐述。在营养匮乏的环境下，细菌DNA的合成，抵抗活性氧类代谢都需要一定浓度的金属离子。Guo等［53］将鱼源无乳链球菌与小鼠巨噬细胞相互作用后，转录组结果显示有大量调节氧气压力，适应缺乏营养物质环境的基因上调。近期，Shabayek等［61］也在无乳链球菌上发现NRAMP同源基因，该基因可以在低pH环境下介导铁离子和锰离子的富集。Cai等［34］研究表明，phoB介导双组分系统在限磷条件下调控毒力基因，因此在营养匮乏的环境下无乳链球菌可通过调控转运蛋白以获取足够编码基因的元素［62］。无乳链球菌通过固有机制，如dlt操纵子催化磷壁酸D-丙氨酰化，抑制抗菌肽的结合，下调D-丙氨酰化会减少细菌表面的负电荷，减少与阳离子结合抗菌肽结合，如硫酸粘杆菌素［57］，无乳链球菌还会与宿主的蛋白激酶C互作，抑制蛋白激酶C的活化［63］，以此抑制宿主细胞相关功能酶的激活。无乳链球菌通过调控转录适应吞噬体的环境形成胞内寄生，巨噬细胞可能作为无乳链球菌的临时避难所，帮助避开宿主的免疫监视，此外无乳链球菌还与海豚链球菌具有相似的机制，利用巨噬细胞的游走能力，伪装成“特洛伊”木马，扩散到其他组织中［55］。

3.2.3 促进吞噬细胞凋亡 无乳链球菌逃避宿主免疫反应和传播的重要策略是引起巨噬细胞凋亡，无乳链球菌可以通过介导吞噬细胞的自噬，而不引起细胞组分的释放，以减少炎症应答［55］。无乳链球菌诱导吞噬细胞的凋亡分两个阶段，胞外阶段和胞内阶段。

当无乳链球菌处于胞外阶段时，通过上调β-H/C的表达，引起巨噬细胞质膜透性缺陷，激活钙蛋白酶可使机体有大量的Ca2+涌入，干扰巨噬细胞肌动蛋白和微管，最终引起细胞骨架退化，导致巨噬细胞凋亡［64］。此外，中等浓度的β-H/C还可促进巨噬细胞抗炎细胞因子IL-10表达和抑制炎症细胞因子IL-12和NOS2表达［65］。无乳链球菌被巨噬细胞吞噬后，吞噬细胞的呼吸爆发产生CO不能杀死无乳链球菌［66］，随着细胞内NO浓度的上升，NO调控吞噬细胞含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）合成［67］，激活的 Caspase在靶蛋白的特异天冬氨酸残基部位进行切割，引起细胞程序性死亡。值得注意的是，该过程并不直接依赖β-H/C的作用［68］，可能是由于吞噬体内环境胁迫，抑制毒力基因表达的结果。此外鼠巨噬细胞的调亡与无乳链球菌表面和菌体裂解液中的 GAPDH 也有关［69］。

巨噬细胞的凋亡对于病原与宿主是一把双刃剑。Wang等［54］用无乳链球菌感染罗非鱼，FasL（Fas配体）在所有的感染组织中表达都上调，体外用无乳链球菌刺激罗非鱼淋巴细胞，出现FasL上调的现象，但是却没有引起淋巴细胞的凋亡或坏死。从宿主角度，宿主介导巨噬细胞凋亡，对病原具有免疫清除作用，同时作为共刺激信号激活T细胞。这可能也是病原逃避宿主免疫清除作用的一个机制，病原将FasL上调到很高的水平，加速巨噬细胞凋亡，减少宿主的免疫应答。由于宿主与病原之间的相互关系复杂，因此对于无乳链球菌介导宿主巨噬细胞的机制还需要进一步研究。

3.2.4 侵染穿透肠道、胃上皮组织 无乳链球菌在生物膜形成后，增加毒力基因的表达，促进细菌侵染肠上皮细胞进入血液中，通过血液循环传播侵染其他组织，无乳链球菌以吞噬细胞作为载体，避开宿主免疫，以类似于肠道生物膜形成机制［36］穿透血脑屏障，引起脑膜炎破坏中枢神经系统，最终导致鱼体免疫系统的瘫痪。

4 展望

无乳链球菌通过口腔进入罗非鱼胃肠道，可能是无乳链球菌感染罗非鱼的主要途径。现阶段，罗非鱼作为研究鱼源无乳链球菌的主要宿主，主要通过腹腔注射进行感染研究，对于口服感染、灌胃等仿自然感染的模型还没有建立，建立自然感染模型有利于了解宿主与病原之间的相互关系，一方面对防治无乳链球菌引起的鱼链球菌病具有重要的应用价值，另一方面无乳链球菌的感染宿主，从水生到陆生都有分布，因此通过对无乳链球菌与宿主之间关系的研究，对于理解病原宿主的协同进化关系具有重要的理论指导意义。

由于无乳链球菌是一种人畜共患的致病菌，因此对其毒力基因、致病机理的研究已经取得了较多的成果，但是现今对于罗非鱼宿主免疫的研究还处于一个发展起步阶段，虽然在体液免疫机理已经得到了较深入的研究，但是许多鱼类特殊的免疫机制还需要进一步研究，如罗非鱼T细胞免疫，通过了解罗非鱼T细胞免疫，找出激活信号通路相关分子，可能是鱼源链球菌病疫苗的下一个突破口，也有利于进一步揭示鱼源无乳链球菌的致病机理。其大体研究思路为：在核酸水平上，利用生物信息学分析的方法筛选并克隆罗非鱼免疫的相关基因，利用CRISPR/Cas9敲除验证基因功能，或者用miRNA干扰沉默基因，验证下游通路基因的表达情况；在蛋白水平上，通过体外重组蛋白制备单克隆抗体，以GST pull-down等方法验证相关通路蛋白的相互作用，研究免疫信号调控通路；通过建立罗非鱼淋巴细胞系在细胞水平上进行验证。

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Transmission routes of Streptococcus agalactiae and the strategy of immune evasion in tilapia

LI Yuan，WANG Bei，WANG Zhi-wen，CAI Xiao-hui，TANG Ju-fen，LU Yi-shan，JIAN Ji-chang
（Fisheries College of Guangdong Ocean University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemilogy for Aquatic Economic Animals/ Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang 524088，China）

Tilapia is one of the most important aquaculture fish in China. In recent years，the tilapia aquaculture industry was seriously damaged by the frequently outbreak of streptococcicosis. In this review，the transmission routes ofStreptococcus agalactiae，intestinal colonization and the mechanisms of immune evasion were discussed aim to provide useful idea for further research on pathogenesis ofS. agalactiaeand the prophylaxis and therapy for streptococcicosis of tilapia.

tilapia；Streptococcus agalactiae；transmission route；intestinal colonization；immune evasion

S917.1

A

1004-874X（2017）07-0132-09

黎源，王蓓，汪志文. 罗非鱼无乳链球菌传播途径与逃避宿主免疫防御策略［J］.广东农业科学，2017，44（7）：132-140.

2017-04-28

广东高校国际合作创新平台项目（2013gjhz0008）；广东省科技计划国际科技合作项目（2017 A050501037）

黎源（1993-），男，在读硕士生，E-mail：mark0622@126.com

鲁义善（1974-），男，博士，教授，E-mail：fishdis@163.com

（责任编辑 崔建勋）