微生物发酵生产聚苹果酸的测定研究

陈 珊，黄艳玲，张 乐，，刘安军

（1.天津现代职业技术学院，天津300350；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

微生物发酵生产聚苹果酸的测定研究

陈 珊1，黄艳玲1，张 乐1，2，*刘安军2

（1.天津现代职业技术学院，天津300350；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

聚苹果酸及其衍生物主要应用在生物医药、食品包装材料等重要领域，其生产方法分为化学合成法和生物合成法，微生物发酵生产聚苹果酸具有较大的优势。通过阐述微生物发酵生产聚苹果酸的菌种、培养基优化、培养条件优化、测定方法、聚苹果酸的提取纯化等方面，以期对聚苹果酸的研究起到促进作用。

聚苹果酸；微生物；发酵

0 引言

聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体，单体间通过-OH和-COOH形成酯键而连接起来的水溶性脂肪族聚酯。目前，聚苹果酸在市场上拥有很重要的地位，因为其主要在医药、食品包装材料、吸水材料、化妆用品行业有广泛应用。它以苹果酸为唯一单体的高分子化合物，主要有α型、β型和α，β型3种结构。存在于生物体内的只有β型聚苹果酸，由于具有特殊结构，使其具有可吸收性和生物降解性。虽然聚苹果酸具有非常重要的经济价值，但是其相关研究非常少，相关报道也不多，尤其是发酵法生产聚苹果酸的报道更是不多。因此，对微生物发酵生产聚苹果酸的研究进行整理具有一定的意义。

1 生产聚苹果酸的菌种

经研究报道，生产聚苹果酸的发酵生产菌种为短梗霉、出芽短梗霉、环状青霉、黏菌等。

1.1 多头绒泡菌

属于黏菌门，它的生活史包括微观的变形虫阶段和巨大多核原质团阶段。对多头绒泡菌合成聚苹果酸（PMLA）的研究多集中在合成机制及调控方面，发酵方面的研究较少。目前，利用P.polycephalum发酵合成PMLA多是采用传统原质团细胞发酵的方法。

1.2 青霉

有研究报道，利用青霉也能够得到聚苹果酸，最早是从圆弧青霉（Penicillium cyclopium）中分离得到一种酸性大分子化合物，这种物质有抑制蛋白酶的活性，后来证明此为聚苹果酸。

1.3 氧化黑酵母

有研究报道，从氧化黑酵母筛选得到了一种能够发酵生产PMLA的菌株，以甘露醇为主要碳源，氮源为硝酸铵，无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁、柠檬酸、吐温80筛选培养基；加入玉米浸泡，丁二酸作为种子培养基，在此基础上改良加入碳酸钙，于25℃条件下培养7 d，得到的发酵液中聚苹果酸的产量为0.4 g/g。

1.4 出芽短梗霉

出芽短梗霉是目前报道最多的产聚苹果酸菌种。刘双江[1]从荷兰和德国菌种保藏中心筛选出2株具有较高产聚苹果酸能力的出芽短梗霉菌株DSM2404和CBS591.75，并对CBS591.75进行2 L和20 L发酵条件的摸索。王丽燕等人[2]分离了1株菌株A.pullulans BS02，并在摇瓶的水平上对发酵聚苹果酸的条件进行了研究，碳源主要采用葡萄糖，培养基中加入50 g/L的CaCO3，控制pH值和温度等条件发酵10 d，聚苹果酸产量可达到30 g/L。Zhang H L等人[3]从新鲜的植物样品中分离得到1株A.pullulans，通过发酵条件进行优化，在摇瓶水平上进行了研究，确定最终合成聚苹果酸的质量浓度达到62.3 g/L；并且对10 L发酵罐试验进行了研究，合成聚苹果酸的质量浓度为57.2 g/L，虽然没有摇瓶水平高，但是也对小型发酵罐研究聚苹果酸具有一定的意义。徐玲芬等人[4]从自然界植物样本中分离得到1株产PMLA的菌株A. pullulansZUCC-41，培养基中加入30 g/L的CaCO3，该菌株发酵合成聚苹果酸的质量浓度为26.2 g/L，其中，发现利用出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸，加入碳酸钙对合成聚苹果酸具有一定的意义。

2 聚苹果酸发酵培养基的优化

研究发酵生产聚苹果酸的菌种多是出芽短梗霉。王丽燕等人[2]利用出芽短梗霉A.pullulans BS02发酵制备生物降解材料聚苹果酸，并在摇瓶水平上进行研究，确定了出芽短梗霉发酵制备聚苹果酸的摇瓶培养条件。其中，优化的培养基为葡萄糖120.0 g/L、丁二酸铵3.0 g/L，丁二酸2.0 g/L，MnSO4·H2O 0.005 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，加入玉米浆以及碳酸钙，在最优条件下，聚苹果酸产量可达到30 g/L。程媛媛等人[5]采用响应面法对出芽短梗霉菌发酵制备β-聚苹果酸的培养基进行了响应面优化，确定了聚苹果酸的最佳培养基配方为葡萄糖、丁二酸铵和碳酸钙，最佳质量浓度分别为110.91，3.66，45.30 g/L，β-聚苹果酸的发酵产量达到41.36 g/L，较优化前的20.74 g/L提高了199%。

3 聚苹果酸发酵生产的发酵条件优化

聚苹果酸发酵条件对产生聚苹果酸的产量也非常重要，接种量、温度、搅拌转速、培养时间对产量都有影响。靳挺等人[6]对出芽短梗霉生产聚苹果酸的发酵条件进行了研究，确定摇床转速220 r/min，温度25℃，发酵培养6 d，最终聚苹果酸的产量达到了16.58 g/L。李睿颖等人[7]对出芽短梗霉发酵合成聚苹果酸进行了研究，确定了最佳生长温度为30℃，最佳产酸温度为25℃，最适接种量为8%。除此之外，利用玉米芯水解液发酵生产聚苹果酸，采用固定化纤维床反应器技术进行重复分批发酵试验，可以提高初始水解糖浓度，聚苹果酸的得率从0.28 g/g提高到0.30 g/g。

4 聚苹果酸发酵代谢途径的研究

乔长晟等人[8]对出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的代谢通量及关键酶活性进行了分析，确定丙酮酸羧化途径及乙醛酸途径是合成聚苹果酸的主要途径，TCA循环途径在发酵后期比较弱，通过酶活分析证明了高产菌株比出发菌株的聚苹果酸合成能力强。

程若东等人[9]对出芽短梗霉积累聚苹果酸途径及调控进行了研究，采用分阶段对发酵温度进行调节，即0～24 h设定发酵温度为30℃，24 h以后调节发酵温度为25℃，搅拌转速400 r/min，通风比1∶1.2，此时聚苹果酸产量为45.2 g/L。

5 聚苹果酸的测定方法

聚苹果酸是一种水溶性脂肪族聚酯，目前检测聚苹果酸的方法主要有酶试剂盒法、纸层析法、高效液相色谱法等。研究表明，高效液相色谱法以及酶试剂盒这2种方法检测聚苹果酸的精度比较高，但是其成本比较高；纸层析法相对较简单，但是方法耗时太长，数据平行性比较差。王凤荣等人[10]对聚苹果酸采用α-2,7-萘二酚法和酶试剂盒法进行了对比研究，结果这2种检测方法都能有效地提取聚苹果酸。

郑谊丰等人[11]采用高效液相法利用Prevail C18型色谱柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）测聚苹果酸的含量，方法的回收率接近100%，是一种非常高效、定量、快速的定量分析方法。

6 聚苹果酸产物的提取和纯化

聚苹果酸提取的难点在于，先要将发酵液中的普鲁兰多糖去除，才能提取出聚苹果酸，但提取聚苹果酸过程中发现发酵液中还有很多副产物多糖。为了减少有机溶剂使用的成本，解除环境问题的影响，因此很多学者对提取聚苹果酸进行了研究。毕艺成等人[12]采用两步超滤膜法对出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸进行了分离与提取，采用离心、超滤、浓缩、沉淀、冷冻干燥获得聚苹果酸，其质量分数可以达到82.3%，提取收率为57.56%。除了利用超滤进行提取聚苹果酸之外，王浩等人[13]利用离子交换法提取聚苹果酸，主要利用D296树脂，最终使得聚苹果酸的纯度达到93.2%，提取收率为79.46%。

7 结论

主要就形成聚苹果酸的菌种、培养基、培养条件优化、发酵代谢途径的研究、聚苹果酸的测定方法以及提取纯化进行了总结，因为聚苹果酸无毒性、无免疫原性、良好生物相容性和生物降解性，因此在医学药学领域发展前景非常广阔，化学法制备聚苹果酸杂质残留太多、步骤繁琐，希望微生物发酵为生产聚苹果酸提供新的途径。

[1]刘双江.出芽短梗霉菌株CBS591.75和DSM2404发酵生产聚苹果酸的研究[J].生物工程学报，1997，13（3）：279-283.

[2]王丽燕，郑谊丰，刘婷婷，等.聚苹果酸的发酵培养条件优化[J].生物加工过程，2010，8（2）：41-45.

[3]Zhang H L，Cai J，Dong J Q，et al.High-level production of poly（β-L-malic acid）with a new isolated aureobasidium pullulans strain[J].Appl Microbiol Biotech，2011，92（2）：295-303.

[4]徐玲芬，陈忠华，赵婧，等.聚苹果酸高产菌株的筛选及鉴定[J].浙江大学学报（医学版），2012，41（4）：434-440.

[5]程媛媛，郑谊丰，王丽燕，等．响应面法优化β－聚苹果酸发酵培养基的研究[J]．食品工业科技，2011，32（5）：197-199.

[6]靳挺，武玉学，陈真，等.出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的研究[J].中国食品学报，2012，12（10）：125-130.

[7]李睿颖，乔长晟，国华，等.出芽短梗霉发酵合成聚苹果酸的研究[J].食品与发酵科技，2011，47（5）：68-71.

[8]乔长晟，郑志达，孟迪，等.出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的代谢通量及关键酶活性分析[J].现代食品科技，2014，30（7）：71-80.

[9]程若东，王浩，周华，等.出芽短梗霉积累聚苹果酸途径及调控研究[J].化工学报，2012（11）：3 639-3 644.

[10]王凤荣，乔长晟，江建梅，等.出芽短梗霉发酵液中聚苹果酸测定方法的比较[J].食品工业科技，2010，31（6）：347-352.

[11]郑谊丰，周华，王丽燕，等.高效液相色谱法测定发酵液中聚苹果酸方法的建立[J].食品科技，2010，35（4）：243-246.

[12]毕艺成，陆宏艳，王浩，等.两步超滤膜法分离提取发酵液中聚苹果酸[J].膜科学与技术，2015，35（1）：97-102.

[13]王浩，郑谊丰，程媛媛，等.离子交换法从发酵液中提取聚苹果酸[J].离子交换与吸附，2010，27（3）：257-263.◇

Study on Production of Poly Malic Acid by Microbial Fermentation

CHEN Shan1，HUANG Yanling1，ZHANG Le1，2，*LIU Anjun2
（1.Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China；2.College of Food Science and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Poly malic acid and its derivatives have important applications in biomedicine，food packaging materials and other fields.The production method of poly malic acid is divided into chemical synthesis and biosynthesis.In this paper，the production of poly malic acid by microbial fermentation，optimization of culture medium,optimization of culture conditions，determination method and extraction and purification of poly malic acid are described.The study on poly malic acid has certain significance.

poly malic acid；microorganism；fermentation

TQ920

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.041

1671-9646（2017）05b-0049-02

2017-04-26

陈珊（1983—），女，硕士，副教授，研究方向为生物反应工程。

*通讯作者：刘安军（1963—），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为水产品、畜产（副产）品高附加值的开发利用及功能性食品研究等。