利用孤雌生殖诱导系诱导单倍体技术在玉米自交系选育中的应用

丁昕颖王俊强黄新育徐艳霞张淑芬付 龙蓝 岚曹立军

（1黑龙江省畜牧研究所，齐齐哈尔161005；2黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院，齐齐哈尔161006）

利用孤雌生殖诱导系诱导单倍体技术在玉米自交系选育中的应用

丁昕颖1王俊强2黄新育1徐艳霞1张淑芬1付 龙1蓝 岚1曹立军1

（1黑龙江省畜牧研究所，齐齐哈尔161005；2黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院，齐齐哈尔161006）

由于单倍体只具有每一对同源染色体及等位基因中的一个，遗传基础单一，单倍体染色体的加倍，相当于同质结合，可得到遗传上稳定、纯合，性状不分离的二倍体纯系。玉米单倍体育种技术能有效地提高选育效率，加快育种进程。与其他玉米常规育种选系技术相比，在自交系纯化方面具有不可替代的优越性。本文简要介绍该项技术在玉米自交系选育中的应用过程，为进一步科学有效地利用提供操作依据。

玉米；诱导；单倍体；自交系；选育

玉米是我国重要的粮饲作物，在我国农业生产中具有重要的地位。同时，畜牧业发展已成为黑龙江省农业发展的重点，针对畜牧业快速发展中优质饲草饲料缺乏的局面，作为饲草饲料之王的青贮玉米，将成为农业生产的重点和发展畜牧尤其是奶产业的关键点，对黑龙江省农牧业生产有着重要的意义。配合力高、抗逆性强、品质优、适应性广的优良自交系是组配出优质、高产、持绿性好的青贮玉米杂交种的基础。采用适当的选育策略，有目的地组配群体，从中选育自交系，可以使自交系的产量和其他经济性状得以有效地改良。

利用单倍体技术选育玉米自交系是以孤雌生殖诱导系作父本与基础材料杂交，使母本产生显著高于自然频率的单倍体，产生的单倍体再经自交加倍产生双单倍体，即为新的玉米自交系。理论上只需要2个生育期即可得到二倍体纯系，可提高育种效率，特别适合我国目前玉米育种实际的需要。

1 单倍体育种技术的作用

玉米育种的成功在很大程度上取决于育种方法、可行性、前瞻性和准确性。玉米新品种的成功选育，其基础在于如何选育高产、高抗、高特殊配合力的优良自交系，是玉米育种的核心部分。玉米单倍体育种技术在自交系纯化方面已逐步成为玉米育种的关键技术。

利用常规育种方法获得纯系需要自交5～7代才能使品系达到基本纯合。利用单倍体育种技术从杂交种到获得纯系只需要2个生育期，所获得的二倍体纯系便可用于杂交种组配，能够大大提高育种效率，加快育种进程。

作为玉米群体改良的主要方法，轮回选择中也可以充分结合单倍体技术。由于单倍体只携带一套基因组，不存在显性基因对隐性基因的掩盖，增加了选择的准确性，提高了轮回选择的效率，同时更有利于发现隐性突变体。多数有害基因控制的性状会导致单倍体种子和植株生活能力下降、高度不育，进而实现自然淘汰，而应用常规方法必须要经过多轮的选择才可实现。

2 具体操作

2.1 选择诱导系 孤雌生殖诱导系可通过杂交诱导使母本产生高于自然频率的单倍体。宜选择诱导率高、花粉量大、散粉持续时间长的诱导系。如国内常用的Stock6、RWS、MHI、农大高诱1号、吉高诱系3号等。平均单倍体诱导率为2．52%～10．4%[1]。

2.2 选择基础材料 基础材料应选择针对性强、适应性广、抗病抗逆性强、品质较好的杂交种、二环系或群体，更容易获得优良自交系。由于不同血缘的基础材料的诱导率和加倍率不同，优先选择诱导率和加倍率高的二环系或群体。要求子粒黄色或白色。

2.3 杂交诱导 种植单倍体地块需要精细整地、基肥充裕、水分充足。单倍体诱导系一般生育期较短，尽量选用花期与基础材料相近的诱导系，或采取分期播种、地膜覆盖促早熟、延期管理促晚熟等系列措施，以确保花期相遇；一般育种计划可以6∶1配播诱导系，当育种规模大、基础材料多时，可采用隔离区内以一父多母（1∶4～5的比例）配播诱导系，以减少人工杂交工作量。

单倍体诱导系与母本材料的杂交授粉与正常杂交相同。极端高温天气时授粉时间在11∶00前为好。凉爽季节，延迟授粉（长花丝≥8cm时）有利于提高单倍体诱导率（提高1．5～2倍）[1]。待果穗完熟后收获，放置晾晒棚中妥善保管。子粒含水量达到标准时脱粒，以减少对子粒的损伤。

2.4 单倍体筛选与鉴定

2.4.1 子粒鉴定方法 根据诱导系的遗传标记系统，杂交所产生的符合胚乳淀粉层为紫色或褐色、胚芽无色的子粒为单倍体子粒，其余的为非单倍体子粒[2]。

2.4.2 植株田间确认 一般在7～8叶期，凡幼苗叶鞘绿色者为单倍体，紫色者为杂交二倍体。另外，单倍体的植株瘦弱、成株矮小（一般是基因型相同的纯合二倍体植株高度的70%左右），并且生长缓慢，叶片较少（一般比基因型相同的纯合二倍体植株少3～4片）、褶皱、收敛、短三角叶型；雄穗短小、颖壳饱满、花粉量极少；大多花期不协调。

2.4.3 其他辅助鉴定方法 近年来，随着国内外各类研究日益丰富，农产品的加工、识别与分级检测，其在玉米品种识别、品质检测等方面的研究内容越来越深入。除根据常规的子粒标记性状鉴定单倍体子粒外，还有很多科学的辅助鉴定方法。如利用农大高诱1号及其衍生系作诱导系时，利用改良的核磁共振仪进行油分含量单粒测定可以实现机械化自动挑选。也可利用细胞遗传学方法鉴定植物体细胞中或减数分裂细胞中的染色体数目，或者从解剖学方向观察叶片表皮气孔、保卫细胞的大小和数目。还可以用电离射线照射（如X射线）叶片和分子标记技术都能够简单而且准确的鉴定单倍体，但需要一定的设备和成熟的操作[3]。

此外，在视觉技术领域，中国农业大学研制的玉米分选试验平台可完成玉米单倍体种子胚部特征提取及动态识别，为玉米单倍体快速分选系统的实现提供了有价值的参考和技术支撑，其对单倍体的识别正确率可达98．04%，对杂合体的识别正确率为94．44%[4]。

2.5 加倍方法 自然状态下单倍体恢复二倍性是细胞的一种本能反应，大多单倍体植株表现为雌雄不调，花粉很少，对有些自然加倍率低的材料需要进行人工加倍。

2.5.1 自然加倍 玉米品种加倍率在自然条件下很低，遗传背景是决定单倍体细胞自然加倍时间和频率的主要因素。当单倍体植株有花药外露并有明显花粉产生时，谨慎取其花药，破开取其花粉，进行精细自交授粉，如次日有花粉应进行二次授粉，同时严格避免外来花粉污染与虫媒花粉传染。

2.5.2 人工加倍 利用化学药剂可破坏细胞有丝分裂的纺锤丝形成，实现染色体加倍。常用的加倍剂有秋水仙素、拿草特、APM、安磺灵和氟乐灵等。主要加倍方法有浸种法、浸根法、浸芽法、注射法、田间喷除草剂和培养基掺入法等[5]。

2.6 双单倍体（DH系）的确认和繁殖 单倍体植株通过自然或人工加倍后所结子粒长出的植株称之为双倍体自交系（DH系），基因高度纯合，性状一致。

选择土地肥力适中、易于田间管理的地块，种植获得的双单倍体子粒，按穗行精细播种，确保出苗。另外，如多个子粒来自同一果穗，播种后植株长势和子粒性状应整齐一致，且不是杂交种株型，即可确认为纯合的DH自交系。如单株的双单倍体植株，符合自交系性状特征且长势良好，应先自交，结实后于下一生育期按穗行播种、繁殖，如果获得的植株长势整齐一致，则即可确认为纯合的玉米DH自交系[6]。单倍体植株授粉后需精心管理，注意一切外在影响因素，成熟后收获所得自交系。下一生育期即可进行配合力测定，用于组建杂交组合。

3 存在的问题

利用单倍体技术选育自交系是一种链条式工程化育种模式[7]。在玉米育种中有效的应用单倍体技术，需要扩大规模，但以小课题组为单位的研究形式难以成功地利用该技术，更适合于规模较大且有实力的育、繁、推一体化的种业公司使用。从技术上来说：难点主要在于单倍体发生的频率低；重组二倍体时染色体加倍具有一定的困难，而通常使用的人工加倍方法效果不明显且对植株和环境都有不同程度的危害，需要探索更有效的加倍方法，提高加倍频率；不能有效地打破不良基因的连锁；基因间的重组几率较低；单倍体种子的鉴定筛选目前主要采用人工方式进行筛选，耗时费力且准确率不高。

另外，由于单倍体基因的随机性高，致使加倍后的纯合二倍体自交系不一定符合育种目标需要，选育成功的几率不高，需要探索一些辅助方法，在DH系形成之前加大选择强度，提高DH系的优质率。

4 发展前景

国外运用单倍体育种技术较早、较成熟，许多玉米商业育种公司已广泛地利用单倍体育种技术，并正逐步替代传统选系方法，以降低育种年限，加快育种速度。近年来随着国内育种水平提高，单倍体育种技术已被育种单位广泛运用，并创制出多个遗传标记能力强、诱导率更高的诱导系，许多科研单位和大型种子企业已在玉米育种工作中应用玉米单倍体诱导技术[8]。

随着玉米商业化竞争加剧，种质资源的创新利用、创新效率急需提升。单倍体育种技术与转基因育种相比，不存在生物安全问题，并且周期短、速度快。可以结合品种设计、分子育种、转基因技术等应用于种质扩增和群体改良等各个可能的领域，为大规模、快速创制玉米的优良DH系种质和大量选育出高产、优质杂交种提供保障[9]。总之，玉米单倍体育种技术正迎来前所未有的机遇与挑战，应用前景将更加广阔。

[1] 才卓，徐国良，Chang M T，等．玉米单倍体育种研究进展[J]．玉米科学，2008，16（1）：1-5

[2] 马海林，李继荣，卢保红，等．玉米单倍体技术要点及其在育种中的应用展望[J]．农学学报，2014，4（9）：25-29

[3] 马骏，姜敏，刘欣芳，等．玉米单倍体育种研究技术的探讨[J]．东北农业大学学报，2011，42（10）：135-139

[4] 张俊雄，武占元，宋鹏，等．玉米单倍体种子胚部特征提取及动态识别方法[J]．农业工程学报，2013，29（4）：119-203

[5] 姜昱，王玉民，王中伟，等．我国玉米单倍体育种技术研究进展[J]．玉米科学，2008，16（6）：48-51，57

[6] 才卓，徐国良，任军，等．玉米杂交诱导单倍生殖选育自交系技术规范（修订版）[J]．玉米科学，2013，21（1）：1-5

[7] 张如养，段民孝，赵久然，等．单倍体技术在玉米种质改良和育种中的应用方向[J]．作物杂志，2012（5）：4-8

[8] 芦连勇，崔俊明，卢道文，等．玉米单倍体诱导系及其在育种中的应用研究[J]．安徽农业科学，2011，39（9）：5145-5147

[9] 刘俊．孤雌生殖诱导玉米单倍体育种技术研究[J]．中国种业，2014（2）：12-14

2016-12-09）