αII-Spectrin的研究进展及法医学应用

王 明，孙宏杰，吴 旭

（1.中国医科大学 法医学院 法医病理学教研室，辽宁 沈阳110122；2.江苏连云港正达司法鉴定中心，江苏 连云港222000；3.无锡市公安局刑事科学技术研究所，江苏 无锡214001）

鉴定综述R e v i e w

αII-Spectrin的研究进展及法医学应用

王 明1，2，孙宏杰3，吴 旭1

（1.中国医科大学 法医学院 法医病理学教研室，辽宁 沈阳110122；2.江苏连云港正达司法鉴定中心，江苏 连云港222000；3.无锡市公安局刑事科学技术研究所，江苏 无锡214001）

αII-血影蛋白是存在于非红细胞系统细胞膜、细胞浆和细胞核内的骨架蛋白，在提供机械性支持、蛋白质分选、囊泡运输、轴突生长、神经递质的释放以及细胞生长分化中起到重要作用。αII-Spectrin表达于神经元胞体、轴突和树突内。在病理条件下，αII-Spectrin可被活化的Calpain-1和Caspase-3分别降解为150-、145-和120-kDa的片段，从而破坏细胞内能量转换和膜的相关功能造成细胞损害。综述了近年来αII-Spectrin在各类脑损伤、神经系统疾病中的表达情况，分析其可成为一个法医实践中推断脑损伤程度和损伤形成时间的新指标。

法医学；αII-血影蛋白；脑损伤；Calpain；Caspase-3

脑是人体的中枢生命器官，也是机械性损伤中极易受累的器官。颅脑损伤的发生率及重型颅脑损伤病人的死残率甚高。颅脑损伤给人类的健康、生命以及社会经济带来严重危害。不同类型的颅脑损伤常伴有不同类型、不同程度的神经细胞损伤，脑损伤后继发性神经元损伤的分子机制一直为国内外学者所关注。αII-血影蛋白（αII-Spectrin，αIISP）是细胞重要的骨架蛋白，在颅脑损伤后发生一系列的生化改变，并产生不同的裂解片段，本文综述了αII-血影蛋白及其裂解片段在各类脑损伤、神经系统疾病中的表达情况，分析其可作为一个法医实践中推断脑损伤程度和损伤形成时间的新指标。

1 αII-血影蛋白

血影蛋白（Spectrin）由α和β亚基组成，是细胞骨架的主要成分之一。在人类中，α-Spectrin有两种亚型（αI，αII）；β-Spectrin有五种亚型（βI~V）。α-Spectrin的C-末端与β-Spectrin的N-末端形成异二聚体，两条异二聚体首尾相接形成有功能的四聚体Spectrin。红细胞内Spectrin称为Spectrin I，首先发现于红细胞；非红细胞Spectrin称为Spectrin II，首先发现于脑，同样存在于其他细胞中[1]。

αII-Spectrin对β亚基的亲和性远远高于αI，其中典型的是αII和βII形成的四聚体Spectrin[2]。有报导称α-Spectrin在缺血性脑损伤中敏感性远远高于β-Spectrin[3]。

αII-Spectrin又称α-胞衬蛋白 （alpha－fodrin），首先发现于神经细胞内，在神经细胞胞体、轴突和突触末端中大量表达，其主要存在于非红细胞系统细胞膜、细胞浆和细胞核内。在细胞膜和细胞浆内作为结构蛋白，参与机械性支持、蛋白质分选、囊泡运输、轴突外展、神经递质的释放以及细胞的生长分化等过程。在哺乳动物细胞核内，可以参与DNA链间交联的修复，作为支架募集修复蛋白参与DNA链间交联的修复过程[4-5]。

2 αII-Spectrin是蛋白酶Calpain-1与Caspase-3的共同底物

2.1 钙激活中性蛋白酶-1

钙激活中性蛋白酶-1（calcium-activated netral protease-1，Calpain-1），因其只需微摩尔浓度钙离子就可激活[6]，又称μ-Calpain，属于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成员之一，参与细胞骨架重建、信号转导及细胞凋亡等过程。Calpain-1多分布于神经系统的神经元胞体、树突，而轴突和胶质细胞中含量较少。Calpain-1的作用底物主要是神经元骨架蛋白，包括血影蛋白、神经丝蛋白及微管相关蛋白等，其主要生理功能是轴突转运、维持细胞结构的完整性及细胞的可塑性。神经元中细胞骨架蛋白的降解、丢失势必引起轴突运输障碍，结构完整性受损，从而使神经元死亡，导致神经功能障碍。在生理状态下，Calpain-1主要以无活性酶原的形式存在；而在病理状态下，细胞出现持续的钙超载时大部分Calpain-1被活化，致使对细胞膜产生失控的过度降解，破坏细胞的结构和功能，最终导致细胞死亡[5-6]。大量的实验结果显示Calpain-1的过度活化可能是引起许多疾病的一个关键因素，如癫痫、局部脑缺血，外伤性脑损伤（Traumatic brain injury，TBI）、蛛网膜下腔出血等[4]。过去认为Calpain主要与细胞坏死有关，但越来越多的研究表明它同样直接或间接的参与细胞凋亡[8-9]；应用抑制剂抑制Calpain激活也成为治疗脑外伤的一个重要途径[10]。

2.2 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific protease 3，Caspase-3）是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族的主要成员之一，是凋亡过程中的核心蛋白酶和关键的执行分子。Caspase-3正常以酶原（32 kDa）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17 kDa）和两个小亚基（12 kDa）组成，裂解相应的底物，最终导致细胞凋亡[11]。

2.3 Calpain-1与Caspase-3的相互作用

过去认为Calpain激活引起细胞坏死，Caspase-3激活引起细胞凋亡。近年来，大量研究表明Calpain亦在凋亡中起重要作用[12]，而且越来越多的研究显示Calpain和Caspase-3很可能在细胞凋亡中共同起作用[13-16]。Esteves等[17]在研究线粒体功能紊乱增强Calpain的活性对帕金森病（PD）的病理作用中发现钙平衡失调致线粒体功能紊乱，激活Calpain。当细胞内钙离子平衡紊乱，致使Calpain活化损伤线粒体，增加线粒体膜的通透性，通过释放细胞色素C、Smac、AIF等途径激活Caspase[18]。在神经细胞凋亡过程中Calpain和Caspase相互作用的研究中发现在凋亡过程中Calpain对Caspase既有正性调节亦有负性调节作用，而Caspase也可以通过降解内源性Calpain抑制剂Calpastatin而间接起到对Calpain的上调作用[16]。目前，关于Calpain-1和Caspase-3之间的相互作用机制并不十分明确。

2.4 αII-Spectrin是Calpain-1和Caspase-3的共同底物

Calpain-1和Caspase-3有许多共同的底物，如膜受体、膜相关蛋白、细胞骨架、结构蛋白、激酶及磷酸酶等[19-21]，其中αII-Spectrin是Calpain-1和Caspase-3共同的底物之一，αII-Spectrin全长240kDa，可由Calpain或者Caspase-3水解产生裂解片段（Spectrin break down products，SBDPs），由Calpain-1介导的裂解片段为150-、145kDa，即SBDP150和SBDP145；而由Caspase-3介导的裂解裂解片段为150-、120-kDa，即SBDP150和SBDP120[22-23]。因此，SBDP145和SBDP120分别是Calpain和Caspase-3的特异性片段，常作为生物学标记用于反映外伤性脑损伤程度及预后等情况[14，23-24]。

3 αII-Spectrin在神经系统损伤与疾病中的表达

αII-Spectrin是一种结构蛋白，大量表达在中枢神经系统，在凋亡和坏死中可以被蛋白酶分解为特征性片段[22-25]。在短暂性脑缺血、外伤性脑损伤等病理条件下，Calpain-1和Caspase-3被激活，选择性水解神经元的结构蛋白αII-Spectrin从而破坏细胞内转换和膜的相关功能而造成神经细胞的凋亡或坏死[26-27]。

3.1 外伤性脑损伤（TBI）

Pike等[28]的实验显示在外伤性或出血性脑损伤时，都存在细胞的坏死和凋亡，Calpain-1参与神经细胞死亡的坏死和凋亡过程，而Caspase-3只参与细胞凋亡，两者均可以裂解 αII-Spectrin形成特异性片段，造成相应神经细胞的坏死和凋亡；Reeves等[29]在研究大鼠弥漫性脑损伤时发现Calpain-1介导的αII-Spectrin片段在大脑皮质和胼胝体内均增多，而由Caspase-3介导αII-Spectrin的裂解片段仅仅在脑皮质一过性轻微增多，在胼胝体内没有表达。同时，αII-Spectrin的裂解阻断了锚蛋白的连接作用而破坏郎飞节的完整性。Chen等[30]收集研究临床急诊严重脑外伤患者病例中，发现脑脊液中SBDPs显著增加，由Calpain介导产生的SBDP145和SBDP150在脑外伤后6 h达到峰值，并且CSF中持续表达达 72 h，推测在早期严重的脑外伤中主要与神经细胞的坏死有关，而Caspase-3介导的SBDP120可能与后期细胞凋亡过程有关。Saatman等[24]指出在外伤性脑损伤后Calpain介导的特异性αII-Spectrin片段 SBDP145等越来越多地被作为TBI的生物学标志物，而在损伤后应用Calpain抑制剂，可以减少轴索等的病理性损害及细胞死亡，因此认为在急性脑损伤后可以将Calpain作为靶向治疗的靶点。Czeiter等[31]发现严重脑外伤时，损伤组CSF中SBDPs的水平均明显高于对照组；损伤24h以内，SBDP145浓度与GCS（Glasgow Coma Scale，功能评分）密切相关，而SBDP120水平与年龄有关；死亡组SBDPs水平显著高于生存组水平；SBDP145（＞6ng/mL）水平和SBDP120水平（＞17．55ng/mL）强烈地预示着死亡[14]。近来，Rachel等[32]发现儿童中重度脑外伤后血清中SBDP145显著增加，且其增加程度与外伤后GCS评分、GOS评分存在显著的相关性，可用于评估脑外伤的程度、治疗及预后。

3.2 缺血性脑损伤

在缺血性脑卒中的研究中发现nNOS（一氧化氮合酶）产生的NO可以活化Calpain和Caspase-3，并裂解Spectrin及map-2加速细胞的凋亡和坏死过程，而7-NI可以下调Calpain和Caspase-3的活性，抑制它们对Spectrin和map-2的降解作用而减少神经细胞的坏死和凋亡[33]。Pike等[23]在研究大鼠大脑中动脉堵塞致CSF中αII-Spectrin片段蓄积的实验中，发现Calpain-1介导的SBDP145增多，而Caspase-3介导的特异性SBDP120并无显著增多，提示CSF中Calpain特异性SBDP145可能对于诊断急性中风更有意义。应用Calpain-1的抑制剂可以减少或阻止这些片段的产生[15]。Weiss等[25]在低温循环骤停（HCA）的实验中，发现脑脊液中Calpain介导的αII-SBDPs在HCA后8 h显著增多，而Caspase-3介导的片段没有明显变化。

3.3 药物性脑损伤

Warren等[13]在研究大鼠皮质神经元急性暴露于去氧麻黄碱和MDMA（俗称摇头丸）时，其结果类似于脑出血或者脑缺血性损伤，Calpain-1和Caspase-3同时被激活，产生Calpain特异性SBDP145和Caspase-3特异性SBDP120，尤其是Caspase-3介导的SBDP120在神经元轴索里明显增多。

3.4 神经系统疾病

Yang等[34]在对衰老的PS/APP阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中神经元凋亡与自噬相互关系的研究中，发现脑组织淀粉样斑块中有Caspase-3表达与活化，脑组织内有活化的Caspase-3及Spectrin裂解片段，提示Spectrin等细胞骨架的破坏在AD形成特异的凋亡形态学特征中起到重要的作用。在癫痫持续状态大鼠模型的海马组织内发现Calpain-1的活化并将Spectrin裂解为SBDP145，但是未检测到Caspase-3的活化及其介导产生的SBDP120[19]。而Wang等[35]在用锂-匹罗卡品诱导癫痫持续状态大鼠模型中，发现Calpain-1和Caspase-3均有活化并裂解αII-Spectrin产生相应的特异性片段，而且Calpain-1介导的海马神经元凋亡过程先于Caspase-3的活化；应用Calpain-1抑制剂MDL28170可以减少SBDP145的表达以及海马神经元的损害作用。

3.5 其他

Newcomb-Fernandez等[36]在原代培养隔区、海马神经元氧葡糖剥夺模型中，发现Calpain和Caspase-3均被激活并裂解αII-Spectrin，产生150-，145-和120kDa片段，形成典型的坏死和凋亡形态学特征。应用Calpain-1抑制剂CI-3（MDL28170）可以减少αII-Spectrin（240kDa）的降解，并且几乎完全阻断了150-，145kDa片段的产生。但在加入Caspase-3抑制剂 DEVD-fmk后 Calpain介导的SBDPs明显减少，由Caspase-3介导的SBDP120并没有明显减少。这个现象的原因尚不明了，可能是由于DEVD-fmk并不仅仅是Caspase-3的特异性抑制剂，还对Calpain-1起作用。

4 总结

αII-Spectrin是一种大量表达于中枢神经系统中的结构蛋白，它是Calpain-1和Caspase-3共同识别的底物。虽然在不同的研究中Calpain-1和Caspase-3的活化不尽相同，但均有程度各异的激活并裂解αII-Spectrin，产生相应的特异性SBDPs，从而破坏了细胞内能量转换和膜的相关功能而造成神经细胞的损害[19，26]。由此可见，αII-Spectrin广泛地参与细胞凋亡和坏死等病理过程，并在脑损伤中起到了举足轻重的作用；而且由Calpain和Caspase-3介导裂解的特异性SBDP145和SBDP120片段，也引起了越来越多的重视，被作为特征性生物学标志物用于检测脑损伤的程度及预后情况，并且抑制αII-Spectrin裂解片段的产生也为脑外伤的治疗打开一条新的途径。以上研究与发现绝大部分是在动物模型和人体中，存在着机体组织间复杂的相互作用，而近来研究它们随时间的表达变化情况也越来越成为一个热点。脑损伤是法医实践中常见而复杂的损伤类型，涉及损伤形成时间更是复杂。鉴于αII-Spectrin与脑损伤的重要关系，研究其在脑损伤中表达变化情况有望可以用于推断脑损伤的程度和损伤形成时间。

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（本文编辑：张建华）

Progress of αII-Spectrin and Its Application in Forensic Medicine

WANG Ming1,2,SUN Hong-jie3,WU Xu1
(1.Department of Forensic Pathology,School of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110122,China; 2.Lianyungang Zhengda Forensic Institute,Lianyungang 222000,China;3.Institute of Criminal Science and Technology, Wuxi Public Security Bureau,Wuxi 214001,China)

αII-spectrin is a structural protein in the cytoplasm of nonerythroid cells.It plays an important role in providing mechanical support for the cell membrane,and it is also involved in protein sorting,organelle and vesicle trafficking,neurite outgrowth and neurotransmitter release,as well as cell growth and differentiation.αII-spectrin is mainly distribute in neuronal cytoplasm,axons and dendrites.Under pathological conditions,αII-spectrin can be cleaved into 150-,145-,and 120-kDa fragments by activated calpain-1 and caspase-3,respectively,thereby disturb the intracellular energy transportation and the related functions of membrane,and cause cell damage.This review summarized the expressions of αII-spectrin in brain injuries and neurology diseases to provide a new biomarker for determining the degree and time course of traumatic brain injury in forensic practice.

forensic medicine;αII-spectrin;brain injury;calpain;caspase-3

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2017.01.005

1671-2072-（2017）01-0045-05

2016-05-31

国家自然科学基金资助项目（8117103）、（81100807）、（81671867）；辽宁省科学技术基金项目（201102264）、（2015020514）；辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2014316）

王明（1982—），男，法医师，硕士，主要从事法医临床、法医病理司法鉴定工作。E-mail:190981578@qq.com。

吴旭（1971—），男，教授，博士，博士研究生导师，主要从事法医病理学、法医毒理学教学、科研与检案工作。

E-mail:wuxu@mail.cmu.edu.cn。