痰湿质酒精性股骨头坏死CYP2C8基因rs17110453位点多态性研究

柳海平++周明旺++李盛华++陈威++叶丙霖++郭铁峰++陈娴

摘要：目的 探讨酒精性股骨头坏死（AIONFH）高发中医体质类型痰湿质与CYP2C8基因多态性关系。方法 选取2014年2月-2015年9月于甘肃省中医院门诊及住院部汉族非创伤性股骨头坏死（NONFH）患者152例，其中AIONFH患者50例作为病例组，同期纳入无血缘关系的健康志愿者45人作为对照组，建立所有患者及志愿者病例资料数据库。判定AIONFH患者中医体质类型，采用溶液型DNA提取试剂盒提取DNA，检测DNA浓度及纯度，采用普通PCR扩增出目的片段，凝胶电泳检测扩增的目的基因，并确认其片段长度，进行目的基因测序，结合凝胶电泳及基因测序结果进行统计分析，得出AIONFH痰湿质、非痰湿质患者与对照组的CYP2C8基因多态性与AIONFH发病关系。结果 比较病例组与对照组的CYP2C8基因rs17110453位点多态性，2组各基因型间差异无统计学意义（χ2=0.253，P>0.05）；2组等位基因差异无统计学意义（χ2=0.077，P>0.05）；病例组CC基因型的发病风险是AA基因型的1.37倍（95%CI：0.339～5.540），两者比较差异无统计学意义（P>0.05）。AIONFH痰湿质患者与非痰湿质、对照组的基因型及等位基因分布差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 CYP2C8基因rs17110453位点多态性A/C突变与痰湿质AIONFH的发病风险无明显联系，未发现CYP2C8基因rs17110453位点多态性与AIONFH明确关系。

关键词：酒精性股骨头坏死；中医体质；痰湿质；基因多态性

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.007

中图分类号：R274.94 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）01-0023-05

Study on Alcohol-induced Osteonecrosis of Femoral Head of Phlegm-dampness Constitution with CYP2C8 Gene Polymorphism LIU Hai-ping， ZHOU Ming-wang， LI Sheng-hua， CHEN Wei， YE Bing-lin， GUO Tie-feng， CHEN Xian （Gansu Province Hospital of TCM， Lanzhou 730050， China）

Abstract： Objective To study the relation between alcohol-induced osteonecrosis of femoral head （AIONFH） related with high morbidity TCM constitution type with CYP2C8 gene polymorphisms. Methods Totally 152 Han nationality NONFH cases from Feburary 2014 to September 2015 from outpatient and the inpatient departments in Gansu Province Hospital of TCM were collected. 50 AIONFH cases were set as medical case group； meanwhile， 45 healthy volunteers were enrolled as control group. Database for medical materials of all patients and volunteers was established. TCM distribution for AIONFH patients was determined. Solution DNA extraction kit was used to extract DNA， and detect the concentration and purity of DNA. The target gene was amplified by PCR and the target gene was amplified by gel electrophoresis. The length of the fragment was confirmed to conduct target gene sequencing. With the results of sequencing and gel electrophoresis， the relation of AIONFH with CYP2C8 gene polymorphism in AIONFH patients with phlegm-dampness syndrome and the control group. Results The CYP2C8 gene loci rs17110453 gene polymorphism was not statistically significant between the two groups （χ2=0.253， P>0.05）. There was no significant difference in allele between the two groups （χ2=0.077，P>0.05）. The risk of disease in CC

基金项目：国家自然科学基金（81473712）；甘肃省自然科学基金（1308RJZA189）

通讯作者：周明旺，E-mail：15117192717@163.com

genotype was 1.37 times higher than the AA genotype （95%CI： 0.339-5.540）， without statistical significance （P>0.05）. There was no significant difference in genotype and allele distribution between AIONFH patients with phlegm-dampness and non-phlegm-dampness and the control group （P>0.05）. Conclusion CYP2C8 gene loci rs17110453 gene polymorphism A/C mutation has no obvious relation with AIONFH risk. There is no clear relationship between CYP2C8 gene loci rs17110453 gene polymorphism with AIONFH.endprint

Key words： alcohol-induced osteonecrosis of femoral head； TCM constitution； phlegm-dampness constitution； gene polymorphism

非创伤性股骨头坏死（n-traumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH），又称股骨头缺血性坏死，属中医学“骨痿”“骨蚀”等范畴。NONFH的发病机制复杂，激素、酒精、镰状红细胞病、代谢性疾病、肿瘤、肾脏移植等均与NONFH的发生有一定联系。即使有上述诸多因素影响，也仅有部分患者发生NONFH，部分个体未出现任何早期症状[1]。这种现象逐渐受到重视，其中，用基因多态性学说来解释上述现象逐渐得到众多学者青睐。

对酒精性股骨头坏死（alcohol-induced osteonecrosis of femoral head，AIONFH）患者中医体质类型深入研究发现，其高发体质为痰湿质[1]。痰和湿是较为常见的病理产物和致病因素，可逐渐引起以“黏滞重浊”为主要表现的体质特征[2]，极易引起脂质代谢紊乱和血液黏滞性增加等异常状态，可能成为AIONFH发病的高危因素[3]。痰湿质与男性过量饮酒、过食膏粱厚味有密切联系[4]。目前，NONFH基因多态性研究主要集中于患者血管内皮细胞功能的相关基因、脂代谢相关基因等，尚缺乏药物代谢相关基因CYP450家族的基因多态性研究。因此，笔者利用基因多态性寻找该疾病的易感基因，探索易感基因与高发中医体质类型之间可能存在的内在分子生物学联系，为预防AIONFH提供新的思路与方法，并为治疗提供一定的理论依据。

1 临床资料

1.1 研究对象

病例来源于2014年2月-2015年9月本院门诊及住院部的汉族NONFH患者。共收集152例患者病历资料及血液标本，建立所有患者及健康志愿者资料数据库。其中AIONFH患者50例为病例组，痰湿质31例，非痰湿质19例，男性46例，女性4例，年龄20～70岁，平均年龄（43.3±11.2）岁；同期收集本院健康体检中心体检的健康志愿者45人为对照组，男性35人，女性10人，年龄18～65岁，平均年龄（39.8±10.6）岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 西医诊断标准

NONFH诊断标准包括临床表现、MRI检查、X线检查、CT检查、核素骨扫描等6项，患者具有股骨头坏死的临床症状且具有其他辅助检查的任意1项，即可诊断[5]。AIONFH的诊断标准：单侧或双侧股骨头坏死、无外伤史、明确长期大量饮酒史（每周饮酒量≥320 mL）[6]。

1.3 中医体质判定标准

依据中华中医药学会《中医体质分类与判定》[7]标准判定。痰湿质多由水液内停、痰湿凝聚引起，主要表现为腹部肥满、容易困倦、喜食肥甘醇酒、口黏、痰多、胸闷、多汗且黏、身重不爽等。本研究中非痰湿质指除痰湿质以外的其他8种体质，包括平和质、气虚质、阳虚质、阴虚质、湿热质、血瘀质、气郁质、特禀质。

1.4 纳入标准

①符合上述诊断标准，包括不同病变程度及治疗方式；②年龄18～70岁；③长期大量饮酒史；④愿意接受病例调查、血液标本采集，能有效配合随访者。

1.5 排除标准

①有明显髋部外伤史并确诊为创伤性股骨头坏死者；②病例调查及血液标本采集过程中不愿继续配合者；③合并类风湿关节炎、强直性脊柱炎、髋臼发育不良等累及髋关节疾病者；④合并严重心脑血管病变或其他严重的代谢异常疾病及骨肿瘤者；⑤精神疾病、智力障碍或无法理解并配合调查者。

1.6 剔除及脱落标准

①依从性不佳，未能按要求完成病例调查者；②病例调查表中一般信息缺失且缺失项目>20%者；③病例调查表关键信息不完整，无法判断具体体质者。

2 方法

2.1 血液标本采集

用含EDTA抗凝剂的无菌管采集患者空腹外周血3 mL，及时混匀并尽快保存至-80 ℃冰箱。在使用血液标本前，避免反复冻融，以免引起DNA提取量严重降低。

2.2 血液DNA提取及其浓度与纯度检测

全血DNA提取采用北京百泰克基因提取试剂盒（溶液型），DNA浓度及纯度测定在甘肃中医药大学中心实验室进行。采用紫外可见分光光度计测定260、280 nm吸光度值（OD）。DNA浓度=50 μg/mL×OD260×稀释倍数；根据OD260/OD280数值判断所提取的DNA纯度，正常检测结果应介于1.8～1.9之间。

2.3 PCR扩增

2.3.1 引物设计 参照文献[8]，确定CYP2C8基因rs17110453位点的引物，扩增片段长度176 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并通过UCSC In-Silico PCR和NCBI BLAST验证。引物序列上游：5'-ACGTTGGATGACACTGATTTCCCTCAA

GGT-3；下游：5'-ACGTTGGATGCTGAAGTAAATGA TTCTATG-3。CYP2C8-F（GC：46.7%；TM：64.8；加35 μL buffer后浓度100 μmol/L的储存液）；CYP2C8-R（GC：36.7%；TM：60.7；加32 μL buffer后浓度100 μmol/L的储存液）。

2.3.2 PCR反应体系 经过多次试验验证，本研究PCR反应最终选择的反应体系为25 μL（见表1）。加样结束后，将EP管放入离心机进行瞬时离心，尽量减少管壁附着。

注：模板DNA使用量为10 pg～1 μg

2.3.3 PCR反应条件 根据引物和2×Taq PCR MasterMix说明书提供的条件进行综合、修改，最终选择反应条件：95 ℃预变性5 min，循环参数：95 ℃变性49 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。endprint

2.3.4 DNA凝胶电泳检测 对已经扩增出来的PCR产物可进行凝胶电泳验证是否为目的产物（电泳结束后采用凝胶电泳成像系统进行观察，通过DNA Marker比对条带位置、清晰度大概判断扩增产物的片段长度和纯度）。产物在送出测序前尽量保存在-20 ℃冰箱，并尽量避免反复冻融，以免影响DNA测序结果。

使用电子分析天平精确称取琼脂糖，配制成2%琼脂糖溶液，轻轻摇匀或用磁力搅拌器混匀，缓慢倒入制胶槽，尽量靠近固定边缘倒入，避免产生气泡或引起胶板过厚影响检测准确度；用微量移液器吸取5 μL DNA Marker加入样品槽，调整电压为120 V，20 min后停止电泳，取出凝胶，采用凝胶成像系统拍照并观察。全部样品送至上海生工进行提纯并测序。

2.4 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以 —x±s表示，采用独立样本t检验；计数资料以频数表示（百分率或构成比），采用χ2检验，计算相应OR值及95%可信区间（CI）。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 电泳结果

PCR扩增产物凝胶电泳结果见图1。

3.2 CYP2C8基因rs17110453位点A/C基因测序

CYP2C8基因rs17110453位点A/C共检出3种基因型：AA基因型、AC基因型、CC基因型。

3.3 各组CYP2C8基因rs17110453位点多态性比较

3.3.1 病例组与对照组比较 比较病例组与对照组的CYP2C8基因rs17110453位点多态性，2组各基因型之间差异无统计学意义（χ2=0.253，P>0.05）；病例组与对照组比较，等位基因差异无统计学意义（χ2=0.077，P>0.05）；病例组CC基因型的发病风险是AA基因型的1.37倍（95%CI：0.339～5.540），差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。提示CYP2C8基因rs17110453位点的基因多态性对NONFH发病风险无明显影响。

3.3.2 痰湿质患者与对照组比较 痰湿质患者与对照组基因型分布差异无统计学意义（χ2=0.317，P>0.05），等位基因分布差异无统计学意义（χ2=0.012，P>0.05）；痰湿质患者CC基因型的发病风险是AA基因型的1.5倍（95%CI：0.321～7.008），差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。

3.3.3 非痰湿质患者与对照组比较 非痰湿质患者与对照组基因型及等位基因分布差异无统计学意义（χ2=0.056，P>0.05；χ2=0.099，P>0.05），见表4。

3.3.4 痰湿质、非痰湿质患者比较 痰湿质与非痰湿质患者基因型及等位基因分布差异无统计学意义（χ2=3.475，P>0.05；χ2=0.000，P>0.05），见表5。

4 讨论

AIONFH作为NONFH比较常见的一种类型，常因长期、大量饮酒引发。早在1972年有学者研究发现饮酒与股骨头坏死之间存在着重要关系，该研究指出，每周饮酒量400～1000 mL的NONFH发生率是<400 mL人群的3倍，当饮酒量>1000 mL时，其NONFH的发生率是<400 mL人群的5倍之多[6]。也有研究发现，AIONFH患者大多存在酗酒或近期内大量饮酒史，部分患者在长期饮酒数年内可能出现单侧或双侧髋关节不适症状[9]。随着近年来饮酒人群的不断增加[10]，AIONFH的发病率可能呈现逐年上升趋势，不排除超过激素成为引发NONFH的最常见因素的可能[3]。至今AIONFH的发病机制尚未完全明确，严重阻碍疾病的治疗，预防该病显得愈加重要。

CYP450是肝酶最常见的一种酶系，主要通过影响体内几乎所有的脂溶性药物在肝脏内的代谢过程，目前在人体鉴别出12种以上CYP450亚族，其中人体药物代谢酶的CYP亚族主要为CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。近年来关于上述几种常见亚型的基因多态性研究相对较多，研究发现上述多种亚型的基因多态性与疾病发生存在重要联系。如Brunner-Ziegler S等[11]研究发现，CYP2C9基因突变的患者股骨颈部位的骨密度较常人明显降低，且CYP2C9基因突变型患者患有骨质疏松的风险比常人高出4倍，并且CYP2C9亚族CYP2C9*2和CYP2C9*3对抗凝药物较常人敏感，上述机制可能与股骨头坏死的发生具有一定联系。Iwakiri K等[12]研究发现，CYP3A4低活性可能引起股骨头坏死并对其发展产生重要影响。

CYP2C8作为CYP450家族中的重要一员，近年来关于其基因多态性的研究相对较少。Yi X等[8]研究发现，CYP2C8基因位点rs17110453的多态性与人体局部缺血性疾病有重要联系，并且该位点的突变可明显提高其发病风险。鉴于近年来众多学说认为NONFH的发生与局部的缺血存在重要关系[13]，本课题研究CYP2C8的基因多态性与痰湿质AIONFH的相关性，旨在明确CYP2C8的多态性与AIONFH发病风险是否具有一定关联，并在此基础上了解容易引起局部缺血的痰湿质[3]与AIONFH之间的分子生物学基础和上述因素之间的重要联系。

本研究结果显示，病例组与对照组的基因型、等位基因差异无统计学意义，提示CYP2C8基因rs17110453位点的基因多态性对AIONFH发病风险无明显影响。痰湿质患者与对照组基因型及等位基因分布分析结果显示，CYP2C8基因rs17110453位点的多态性与痰湿质无直接关系。

上述研究结果并不能完全说明CYP2C8基因多态性与AIONFH痰湿质患者之间没有必然联系。其原因可能有以下几点：①本项研究的结果建立在50例AIONFH的基础上，可能样本量过小，对研究结果产生偏倚，从而影响了结果的准确性；②CYP2C8基因存在众多可能致病的位点，本研究所选择的rs17110453位点可能与该病的相关性较弱，不排除该基因其他相关位点与痰湿质AIONFH存在重要联系，需要进一步选取更多的样本、位点进行研究；③CYP2C8作为CYP450家族中比较重要的一种亚型，该基因可能在人体的代谢作用与酒精之间的关系不够紧密或者没太大影响，从而出现该基因位点的多态性与AIONFH无显著关系。endprint

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（收稿日期：2016-04-27）

（修回日期：2016-05-11；编辑：季巍巍）endprint