不同免疫抑制剂对小鼠罹患侵袭性肺曲霉病的影响

陈玉宝 陈菲菲 邹春芳 邵宏涛

(南京医科大学附属南京医院 (南京市第一医院)呼吸科,南京 210006)

·论著·

不同免疫抑制剂对小鼠罹患侵袭性肺曲霉病的影响

陈玉宝 陈菲菲 邹春芳 邵宏涛

(南京医科大学附属南京医院 (南京市第一医院)呼吸科,南京 210006)

目的 比较两种免疫抑制状态造成侵袭性曲霉感染 (IPA)后天然免疫反应的异同。方法 清洁级雄性BALB/c小鼠，分别使用地塞米松 (A组)及环磷酰胺 (B组)预处理后气道接种烟曲霉孢子建立IPA模型。观察小鼠存活率，肺病理检查，评估肺部及肺外脏器真菌负荷；支气管肺泡灌洗液 (BALF)检测促炎、抗炎细胞因子浓度。结果 A组小鼠平均生存期与B组比较有显著差异。病理提示A组小鼠肺组织有大量炎症细胞聚集；B组可见到典型的曲霉菌丝浸润性生长。B组小鼠肺部烟曲霉CFU、烟曲霉18s rRNA较A组升高；B组肺外各脏器与A组比较均具有统计学差异。检测BALF中炎症因子：A组TNF-α未检测到，IL-10峰值在72 h出现，IL-1α自第一天起即升高，第3天达峰值；B组TNF-α及IL-10在24 h后均明显升高，于48 h达峰值；IL-1α一直在低水平维持；B组与各组间比较，TNF-α、IL-1α及IL-10均有显著差异。A、B两组IL-1β表达在接种烟曲霉后均迅速升高，并一直在高水平维持，两组间无差异。结论 不同预处理造成小鼠免疫抑制后建立IPA模型，激素组肺部出现明显的炎症反应；环磷酰胺组可出现显著的全身真菌播散。

侵袭性曲霉感染；动物模型；小鼠；免疫；致病机制

[Chin J Mycol，2017，12(3):135-139]

侵袭性肺曲霉菌病 (invasive pulmonary aspergillus,IPA)是一种严重危及生命的肺部感染，当宿主免疫力低下或者吸入孢子数量超过气道防御屏障清除能力时，曲霉孢子即可侵入机体导致侵袭感染。根据我国最新的侵袭性真菌病流行病学调查，曲霉感染占全部确诊肺真菌感染病例的37.9%，是最常见的致病真菌[1]。在2010年第4届真菌治疗国际会议大会报道中提出[2]：40%IPA感染为非粒缺、非血液病患者。致死率较粒缺患者高 (90% vs 60%)。慢性阻塞性肺部疾病 (COPD)[3-4]长期使用激素及ICU患者[5]具有发生IPA的高风险性。本病的临床症状、体征和影像学缺乏特异性，并且难以获得组织证据，故难以确诊。该类患者即使经过抗真菌治疗其病死率仍高达80%～90%。因此，用动物模型分析IPA的发生发展可以为早期诊治IPA提供实验依据。

近年来针对曲霉感染的免疫研究发现：吞噬细胞 (中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)[6-7]在抗真菌的保护性反应中是必须的，如果此类细胞减少或功能缺陷，均将导致对曲霉的易感。虽然早期由中性粒细胞和巨噬细胞介导的天然免疫反应足以控制部分真菌，但是对大多数致病菌而言，需要有树突状细胞、单核细胞等参与的适应性免疫反应。宿主免疫抑制状态不同会否造成不同的疾病过程及预后？本实验拟通过化疗药物或激素预处理造成免疫抑制后建立小鼠IPA模型，以此探讨不同免疫抑制状态下肺部局部和全身反应及机体的天然免疫反应的异同。

1 材料与方法

实验动物 清洁级健康雄性BALB/c小鼠120只，6～8周龄，平均体重 (20±2) g。分笼饲养于南京医科大学中心动物所洁净、温控的动物实验室，实验室定期消毒，通风良好，室温保持在20～25℃，采用全饲料营养。小鼠可以正常摄食、饮水。所有动物都是按规定要求使用，通过南京医科大学动物伦理审查，实验动物许可证号SYXK (苏)2009-0015。

实验材料 烟曲霉 (A.fumigatus)AF293菌株由中科院微生物所赠送。环磷酰胺 (cyclophosphamide，CY)、地塞米松及戊巴比妥钠，均购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

烟曲霉孢子悬液制备 将烟曲霉菌株接种于沙堡弱培养基，于霉菌培养箱中35℃培养5 d。以含0.02%吐温80的无菌生理盐水收获孢子并定量。

实验动物分组及免疫缺陷/抑制预处理 随机分为4组：A组，激素组 (地塞米松+AF)：于d-1～-3、d0、d2、d4腹腔内注射地塞米松，50 mg/kg。B组，化疗组 (环磷酰胺+AF)：d-1、d0、d1连续3天腹腔注射环磷酰胺，250 mg/kg。C组，对照组 (生理盐水)：d-1、d0、d1天腹腔内注入生理盐水。D组，对照组 (生理盐水+AF)。

烟曲霉感染模型的建立 通过气管插管，A、B组气管内滴入烟曲霉的方式建立感染模型。C组滴入生理盐水作为对照，D组滴入烟曲霉对照。以2%戊巴比妥钠 (30 mg/kg)麻醉小鼠后经口气管插管，每只气管内滴入1×107孢子。小鼠麻醉清醒后自由活动、饮水。为预防细菌感染，接种当日予庆大霉素6 mg/kg肌注1次，接种后直至实验结束予环丙沙星660 mg/L置于水中饮用。每组均随机抽取8只小鼠行感染后死亡率观察。未死亡小鼠于第7天脱颈处死。其余小鼠观察感染后1周内死亡情况。分别于接种后第1、2、3天随机处死小鼠，每组至少5只。

支气管肺泡灌洗液 (BALF)获取 操作步骤参照前实验[8]，取上清液100 μL做细胞分类，余冻存于-80℃冰箱待用。

观察指标 小鼠感染后一般情况，包括体重、死亡、活动。

组织病理 为观察不同预处理后曲霉肺部情况，接种后第3天处死小鼠，左下肺浸入4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，5 μm连续切片，脱蜡，HE及PAM染色，光学显微镜下观察组织病理改变。

真菌负荷计量 (1)菌落计数。第3天处死小鼠，无菌条件下取新鲜右上肺、肾脏、肝脏、脾脏并匀浆化，电子天平称重后按1 g湿组织：10 mL含0.1%吐温80磷酸盐缓冲液比例稀释，取10 μL、100 μL稀释液分别接种于两块沙堡弱培养基平板上，置于真菌培养箱内培养，24 h后读取平板菌落数，组织的真菌负荷以log10 CFU/g组织表示。(2)烟曲霉18s rRNA测定。第3天处死小鼠，右下肺、肾脏、肝脏、脾脏组织提取RNA，采用Real-time PCR测量烟曲霉18s rRNA (GenBank accession number AB008401)，用标准曲线定量烟曲霉孢子。引物设计见表1。操作步骤按试剂盒说明书进行。

炎症因子检测 分别于第1、2、3天处死小鼠，获取BALF标本冻存，采用市售ELISA试剂盒做TNF-α、IL-10、IL-1α、IL-1β检测。

统计分析 感染后以实验小鼠存活率为纵轴，时间为横轴绘制生存-时间曲线。采用SPSS 21.0进行数据统计分析，所有计数资料以均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验，多组计量资料间的比较采用one-way ANOVA分析，寿命表法分析生存时间，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 存活率

观察7 d，A组小鼠接种后第2天开始出现死亡，第5天死亡率最高，有2只小鼠存活超过1周。B组小鼠接种后8 h即死亡1只，其余均于4 d内死亡；A组小鼠平均生存期5.33 d，与B组2.5 d比较，差异有统计学意义 (P=0.022)(见图1)。C、D组小鼠均存活。

2.2 一般情况

接种烟曲霉孢子后B组小鼠4 h后即出现发热、纳差、活动减少、呼吸急促；第1天起出现偏盲，肢体偏瘫等脑部播散症状；第2天起出现少尿，呼吸困难加重，口唇出现紫绀，肺部听诊出现大量干湿性罗音；A组小鼠自第2天起出现呼吸急促、纳差等反应并持续存在，但直至处死均未出现偏盲、少尿等肺外脏器播散症状。

2.3 肺组织病理

对死亡小鼠解剖取肺脏，C组、D组小鼠肺呈粉红色，无组织肿胀及出血；感染组小鼠肺组织呈暗红色，可见明显出血坏死灶，B组小鼠大部分可见肺表面脓肿。A组小鼠肺组织病理切片第1天起肺部可见大量中性粒细胞浸润，灶状组织坏死；B组小鼠可见明显的坏死性出血性炎症，局灶性血管栓塞等病理改变，第3天起可见到典型的曲霉菌丝，即45°角带隔菌丝。对照组 (C组、D组)小鼠肺组织内无菌丝生长，未见肺实质坏死、炎症细胞浸润，肺泡内未见红细胞聚集现象 (见图2)。

2.4 BALF细胞分类

A组小鼠接种曲霉后第1天起BALF中性粒细胞明显增高并维持在高值，无动态改变，平均5.71×106±1.6×105/L，B组接种第1天中性粒细胞为4.18×105±9.65×104/L，后迅速下降，第2、3天测定中性粒细胞近乎0，各时间点两组比较差异均有统计学意义 (P<0.001)；A、B组巨噬细胞第1天无明显差异 (2.59×105±0.97×105/L VS 2.28×105±1.05×105/L)，A组巨噬细胞自第2天起逐步升高，平均3.33×105±1.12×105/L，B组稍有升高，2.43×105±6.61×104/L，两组间比较无统计学差异 (P=1.05)(见图3)。

2.5 真菌负荷检测

A组小鼠肺部曲霉CFU在d1升高 (62±13.34 LgCFU/g)，后随时间下降，与B组比较差异有统计学意义 (P<0.001)，与C组及D组比较，差异均无统计学意义 (P=0.019,0.224)。B组小鼠接种后d1肺部曲霉CFU即升高，d2、d3逐渐升高，d3达峰值 (444.67±64.9 LgCFU/g)；B组与C组、D组在各个时间点均有明显差异。自第2天起，B组肾脏、肝脏、脾脏曲霉CFU均明显增高，A组仅脾脏中d3曲霉CFU稍增高，肾脏、肝脏中均未测出曲霉CFU，各脏器两组间比较均具有统计学差异 (P<0.001)(见图4)。C组各组织曲霉CFU均未测出，D组肺组织曲霉CFU d1天稍增高，d2、d3均未测出，其余组织曲霉CFU均未测出，两组间比较无差异。B组肺组织烟曲霉18s rRNA测定持续增高，肾脏、肝脏、脾脏18s rRNA均明显增高，与A、C、D组比较，各时间点均有统计学差异 (P<0.001)(见图5)。A组在d1增高，后逐渐下降，与C组及D组比较差异无统计学意义 (P>0.05)。

2.6 炎症因子检测

感染烟曲霉后分别于第24、48、96 h获取BALF行炎症因子检测。结果显示A组TNF-α未检测到，可能与激素抑制NF-κB通路有关；IL-10峰值在72 h出现 (86±15 pg/mL)。B组TNF-α及IL-10在24 h后均明显升高，于48 h达峰值，分别为 (3 120±393，434±97 pg/mL)；D组TNF-α 48 h时升高，但迅速降至阈值以下，而IL-10未测出，C组与D组有类似表现，但TNF-α峰值明显低于D组。B组与各组间比较，TNF-α及IL-10差异均有统计学意义 (P<0.01),而A组与C、D组比较均无统计学差异 (见图6)。IL-1α在激素组的BALF中自实验第一天起即升高，后逐渐升高，第3天达峰值；而在环磷酰胺组第一天升高后未再出现进一步变化，一直在低水平维持，两者间比较有统计学差异 (P<0.001)，C、D组均无IL-1α表达。IL-1β趋势与IL-1α不同，A、B两组在接种烟曲霉后均迅速升高，并一直在高水平维持，两者间差异无统计学意义 (P=0.926)，D组IL-1β稍有升高。实验组与对照组间均有显著差异。

图1 小鼠生存率曲线 图2 小鼠肺曲霉菌感染病理：A.激素组 (地塞米松+AF);B.化疗组 (环磷酰胺+AF);C.对照组 (生理盐水);D.对照组 (生理盐水+AF);C,D.HE染色 (×200);A,B,C-d3,D-d3.六铵银染色 (×200) 图3 BALF细胞分类 图4 感染后各组织曲霉CFU测定 图5 感染后各组织烟曲霉18s RNA测定 图6 感染后BALF中炎症因子浓度

Fig.1 Survival curves of mice Fig.2 Pathological examination of mice:C and D.Micrographs of hematoxylin and eosin stain of lung tissues (×200);A,B,C-d3,D-d3.Micrographs of Gomori sliver staining of lung tissues (×200) Fig.3 Cytological claasification in BALF Fig.4 Pulmonary fungal burdens of mice in tissues Fig.5 Detection ofAsp18s rRNA in tissues Fig.6 Expression of cytokines in BALF of mice

3 讨 论

正常机体吸入烟曲霉孢子后可引起一个轻度、短暂的炎症反应从而清除孢子，并不会引起肺部损害。肺泡巨噬细胞、肺单核细胞、气道上皮细胞是抵抗曲霉菌感染的第一道防线，其后中性粒细胞和CCR2+炎症细胞招募至气道发挥抗真菌的作用。IL-1基因的多态性在人类对IPA易感或抵抗中起着重要作用[9]。IL-1基因编码IL-1α、β能提高免疫反应，两者成熟过程并不相同。曲霉感染后IL-1β的产生与MLRP3炎症子激活有关，而后者缺乏增加小鼠念珠菌播散。Caffrey[10]在模式小鼠的曲霉感染模型中发现支气管肺泡灌洗液中IL-1β在12 h内明显升高，而肺组织IL-1α表达在48 h内持续增高。同时有研究[11]发现IL-1α较IL-1β对白细胞的招募更为关键。我们的实验发现IL-1α在激素组和环磷酰胺组的表达趋势不同，激素组更为显著，而两组IL-1β的表达则无明显差异。这与一个全身性念珠菌感染模型[12]中得到的结论类似。这可能与环磷酰胺造成粒细胞缺乏，无法有效招募中性粒细胞有关；而激素抗炎反应主要是抑制NF-κB通路，IL-1β仅对巨噬细胞的抗真菌活性有关。

我们的实验显示，环磷酰胺预处理后除可引起肺部严重的曲霉侵袭外还可导致曲霉的全身播散，与国内外临床观察及动物实验结果一致，这可能与环磷酰胺引起的粒细胞减少使机体不能有效清除菌丝有关[13]。而在激素组肺部病理表现为中性粒细胞的聚集，出血坏死而无明显菌丝形成，且肺外脏器的真菌负荷小，这与Graybill等[14]的研究结果类似。他们报道用粒细胞集落刺激因子治疗使用激素的小鼠是有害的，可以导致白细胞升高，肺部出现大的脓肿。同时认为大量中粒迁移至感染部位反而造成曲霉肺部炎症的扩大。这与中性粒细胞活化后大量释放氧自由基、抑菌肽，加重局部炎症反应有关[15-17]。一些免疫抑制细胞因子如IL-10、IL-4均能通过抑制吞噬细胞的抗真菌活性而导致对曲霉的易感。本实验发现使用环磷酰胺后BALF中TNF-α及IL-10均明显升高，而激素预处理后，仅表现为IL-10轻度升高，这与前期的研究结果类似[18]，表明在机体抗曲霉中TNF-α有保护性作用而IL-10的过度升高与IPA的致病有关。在环磷酰胺组虽然有高TNF-α，但因粒缺，TNF-α招募粒细胞的作用并不能表现出来而导致死亡率增高。

本实验发现2只地塞米松预处理后的小鼠脾脏中第3天曲霉CFU稍增高，而烟曲霉18s RNA的检查为阴性，考虑与检查方法有关。据报道[19]，在脏器中丝状真菌常成堆生长，与在培养基中的单个集落单位无法区分，故CFU测定不能准确反应感染丝状真菌如烟曲霉的数量。因此检测烟曲霉18s RNA更能反应脏器真菌负荷，减少假阳性。此外，我们的实验还发现D组肺组织CFU第1天稍增高，这可能与造模方式系经气道接种有关。

我们的实验尚存在一定缺陷。在未来的研究中拟通过评估T细胞亚群、巨噬细胞分型来进一步分析曲霉感染后免疫状态与严重度的相关性；通过亚组分析来判断增大激素剂量或延长使用时间对肺部感染和播散的影响，以更好的为临床诊治IPA提供基础数据。

本实验结果显示IPA的发生、发展与不同的免疫状态密切相关，机体的天然免疫能力在抗曲霉中起着重要的作用。

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[本文编辑] 王 飞

Comparison of two immunosuppressive agents on the infection and inflammation of experimental invasive pulmonary aspergillosis mice models

CHEN Yu-bao,CHEN Fei-fei,ZOU Chun-fang,SHAO Hong-tao

(DepartmentofRespiratoryMedicine,NanjingFirstHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210006,China)

Objective To establish an experimental immunosuppressed mice model of invasive pulmonary aspergillosis (IPA),to evaluated various parameters of the innate immune response during the progression of IPA.Methods Immunosuppressed mice

the intratracheal administration ofA.fumigatusconidia after two immunosuppressive treatments:a corticosteroid (group A) and a cyclophosphamidum agent (group B).We compared host responses 24 h,48 h and 72 h after infection in terms of survival,lung tissue histopathological analysis,fungal burden,pulmonary production of pro- and anti-inflammatory cytokines.Results The group A showed longer survival than group B did (5.33 vs 2.5 d,P<0.05).Group A showed severe bleeding and congestive,and lung tissue granuloma formation;while group B showed visibleA.fumigatushyphae,tissue necrosis 48 h after infection.Through CFUs andA.fumigatus18sRNA detections,fugal burdens were significantly lower in lungs of corticosteroid-treated mice than those of cyclophosphamidum-treated mice.This difference was also observed in livers and kidneys,indicating that the level of fungal dissemination was higher in group B than that of group A.In group B mice,the IL-10 concentration increased by 48 h after infection and peaked at 72 h (86+15 pg/mL).No TNF-α production was detected.In group A mice,both TNF-α and IL-10 were detected at very high concentrations at 48 h (3 120±393，434±97 pg/mL).IL-1α expression increased 24 h after infection in group A mice and continually increased within the 3 days.But in group B,IL-1α concentrations maintained with low level.In both group A and B,the expressions of IL-1β increased dramatically after infection.Conclusion Establishing the IPA animal models of the mice by corticosteroid and chemotherapy-treated,We found that IPA pathogenesis was difference between the two groups:the inflammation response of lung was severe in corticosteroid-treated mice than those in chemotherapy-treated mice,while chemotherapy-treated mice showing an adverse host response.

invasive pulmonary aspergillosis；animal model；mice；immunology；pathology

国家自然科学基金 (81200004)，南京市医学科技发展重点项目 (ZKX13014)

陈玉宝，女 (汉族)，硕士，主治医师.E-mail:interloper9@163.com

邵宏涛,E-mail:shaohongtao111@126.com

R 519.8

A

1673-3827(2017)12-0135-05

2016-12-08