夏枯草配方颗粒高效液相色谱特征图谱研究

胡 莲，周 杰，袁 慧

(西南医科大学附属医院药学部，四川 泸州 646000）

夏枯草配方颗粒高效液相色谱特征图谱研究

胡 莲，周 杰，袁 慧

(西南医科大学附属医院药学部，四川 泸州 646000）

目的建立夏枯草配方颗粒高效液相色谱（HPLC）特征图谱。方法色谱柱采用Welch Materials AQ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相为乙腈－0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.8 mL／min，检测波长为280 nm，进样量为10 L。结果建立了夏枯草配方颗粒的特征图谱，标定其中6个特征峰，以迷迭香酸参照峰的保留时间为1 min，计算各特征峰的相对保留时间分别为0.260(峰1)，0.404 (峰2)，0.540(峰3)，1.000(峰4)，1.360(峰5)，1.836(峰6)，13批夏枯草配方颗粒样品检测均符合规定。结论该方法简便、稳定，重复性好，可作为夏枯草配方颗粒的鉴别依据。

夏枯草；配方颗粒；特征图谱；高效液相色谱法

中药配方颗粒是在中医药理论指导下，采用现代科技手段，将传统中药饮片按一定生产工艺制成的提取物，与适当辅料或药材细粉制成的供临床调剂使用的粉状或颗粒状产品。其突破了传统中药饮片需要煎煮的服用模式，既满足临床辨证论治和随证加减的需要，又具有免煎易服、易储存、携带方便等优点[1－3]。2001年，我国开始正式将中药配方颗粒纳入中药饮片管理范畴[4]。目前，国内越来越多的中医院开始接受中药配方颗粒，这一“新型饮片”已逐渐得到患者和医生的认可[5]。中药饮片经过一系列制剂工艺加工制成配方颗粒后，失去了原饮片的许多外观、显微及理化特征，无法再用常规的技术手段(如显微观察、理化反应)进行有效鉴别。因此制订特征性强、准确表征配方颗粒剂的质量控制方法显得尤为重要[6－8]。特征图谱是中药配方颗粒的一个重要质量指标[9]，但是如何获得专属性强、可靠性高、可以准确表征配方颗粒质量的特征图谱，鲜有文献报道。对中药配方颗粒进行特征图谱研究，有助于改善真伪难辨、质量标准不统一的状况。

夏枯草为唇形科植物夏枯草 Prunella vulgaris L.的干燥果穗，味苦、性寒、辛，具有清肝、明目、散结、消肿、止痛之功效，用于目赤肿痛、目珠夜痛、羞明流泪、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛[10－13]，现代临床多用于治疗甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生、高血压、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎等疾病[14]。夏枯草配方颗粒是夏枯草单味药经煎煮、浓缩、干燥等步骤制成质量均一的颗粒剂，其性味、归经、功效与原饮片基本一致，用于中医临床配方[15]。本研究建立夏枯草配方颗粒的高效液相色谱(HPLC)特征图谱，标定了6个特征峰，并指认了其中2个特征峰的结构，可为夏枯草配方颗粒的采购、生产及临床应用提供科学参考依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪(包括QuatPump四元泵、VWD紫外检测器、ChemStation工作站(美国Agilent公司)；GR－202型电子分析天平(日本)；KQ500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

迷迭香酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111871－201404）；13批不同厂家夏枯草配方颗粒由本院提供，编号为S1～S13；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：WelchMaterialsAQ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：280 nm；柱温：30℃，进样量：10 μL；流速：0.80 mL／min；流动相：乙腈－0.1%磷酸，梯度洗脱，见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序表

2.2 溶液制备

参照物溶液：精密称取迷迭香酸对照品适量，加稀乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供试品溶液：取夏枯草配方颗粒粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率 50 kHz)30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 共有峰标定及相似度计算

根据13批夏枯草配方颗粒样品(S1～S13)的高效液相色谱所给出的相关参数，比较样品色谱图。其中各批样品共有的峰有6个，确定为共有峰。在共有峰中，以迷迭香酸峰(S峰)的保留时间为1，计算各共有峰相对保留时间的 RSD。采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件对样品色谱图进行相似度评价。

2.4 方法学考察

稳定性试验：取同一供试品溶液(S1样品)，分别于0，3，6，9，12 h时进行检测，以迷迭香酸峰(S峰)的保留时间为1，考察样品溶液的稳定性。结果6个共有峰相对保留时间的 RSD在0.05%～0.74%(n＝6)范围内，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

精密度试验：取同一供试品溶液(S1样品)，连续进样6次，依法测定，以迷迭香酸峰(S峰)的保留时间为1。结果6个共有峰保留时间的 RSD在0.02%～1.31%（n＝6）范围内，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批(S1样品)样品6份，按拟订方法制备供试品溶液并进行测定，以迷迭香酸峰(S峰)的保留时间为1，考察试验方法的重复性。结果6个共有峰相对保留时间的 RSD在0.03%～0.28%（n＝6）范围内，表明方法重复性良好。

2.5 特征图谱的建立

2.5.1 特征图谱采集

按2.3项下方法制备13批夏枯草配方颗粒供试品溶液，进样测定，记录色谱图。见图1。

图1 13批夏枯草配方颗粒样品特征图谱

2.5.2 共有峰标定

采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件，自动匹配13批夏枯草配方颗粒HPLC图谱所给出的相关参数，以平均数法生成对照特征图谱（图2）。匹配数据显示，所有样品HPLC图谱共有6个共有峰，通过与对照品色谱图比较，可知峰3为咖啡酸，峰4(S)为迷迭香酸。在特征图谱中，以迷迭香酸峰(S峰)的保留时间为1，计算各共有峰的相对保留时间分别为 0.260，0.404，0.540，1.000，1.360，1.836。13批样品HPLC图谱中，以迷迭香酸峰为参照峰，积分参数斜率灵敏度为3、峰宽为0.04、最小峰面积为50，计算特征峰与参照峰的相对保留时间，结果均在规定值的±5%之内，见表2。

2.5.3 特征图谱相似度评价

采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件，自动匹配13批夏枯草配方颗粒样品HPLC图谱的相关参数，通过“相似度计算”功能对样品色谱图进行相似度评价。结果13批样品的相似度在0.982～0.995范围内，说明13批样品成分一致性较好。

图2 夏枯草配方颗粒对照特征图谱

表2 13批夏枯草配方颗粒样品特征峰相对保留时间

3 讨论

3.1 提取条件优化

考察了不同极性的溶剂(甲醇、80%甲醇、50%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇)对夏枯草配方颗粒的提取效果，结果80%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙醇提取的色谱特征峰数基本一致，70%乙醇溶液提取的吸收较强，故选择70%乙醇作为提取溶剂。比较了超声提取、水浴回流提取、振摇提取等不同提取方式，差异不大，考虑到操作的简便性，因此采用超声提取的方式。

3.2 流动相选择

分别考察以甲醇－水、乙腈－水、甲醇－磷酸、乙腈－磷酸等为流动相进行线性梯度洗脱，同时改变酸的浓度，结果在乙腈－0.1%磷酸系统下，色谱特征峰数目较多，分离效果较好。

3.3 检测波长选择

采用DAD检测器在210，230，254，280，330 nm波长下分别进行检测，结果在210 nm波长下色谱峰数目最多，但基线漂移，而280 nm波长下吸收较强、色谱信息量较大，故选择280 nm为检测波长。

中药配方颗粒已不具备中药饮片的外形，中药饮片所特有的“性状”及“显微鉴别”也不复存在，鉴别方法完全依赖于化学分析手段。目前，应用于中药配方颗粒鉴别的技术方法报道较少，主要有薄层色谱、傅里叶－红外光谱及HPLC指纹图谱等，其中以薄层色谱鉴别最常用[16]。特征图谱的研究比指纹图谱较简单，但能很好地给中药产品的定性鉴别提供准确依据，其在中药配方颗粒质量标准研究方面的应用得到了国家药典委员会的认可和推崇。

本研究中建立了夏枯草配方颗粒的HPLC特征图谱分析方法，从所得特征图谱的分析结果来看，各批样品的相似度高、均一性较好，各共有峰的相对保留时间较稳定，具有专属性。所建立的方法简便、稳定，重复性好，可作为夏枯草配方颗粒的鉴别依据，为采购、生产及其质量控制提供科学依据。

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Study on the HPLC Specific Chromatogram of Prunella Vulgaris Formula Granules

Hu Lian,Zhou Jie,Yuan Hui
(Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan,China 646000)

Objective To establish the HPLC specific chromatogram of Prunella Vulgaris Formula Granules.M ethods The specific chromatograms were analyzed by Welch Materials AQ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)and eluted with gradient acetonitrile and 0.1% phosphoric acid at a flow rate of 0.8 mL／min,detection wavelength of 280 nm,and sample volume of 10 μL.Results The specific chromatograms of Prunella Vulgaris Formula Granules were obtained.There were 6 characteristic peaks,and among them were 1 min identified by direct comparison with reference substances.The peak of rosmarinic acid is S peak.Calculate the relative retention time of each characteristic peaks and the S peak;the relative retention time should be 0.260(peak 1),0.404(peak 2),0.540(peak 3),1.000 (peak 4),1.360(peak 5),1.836(peak 6).Measure these 13 samples and the result was in accord with regulation.Conclusion The HPLC specific chromatograms is proved to be simple,stable and reproducible,and it can provide reference for the identification of Prunella Vulgaris Formula Granules.

Prunella vulgaris;formula granules;specific chromatograms;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2016)24－0016－04

胡莲（1979－），女，大学本科，药师，研究方向为中西药联用和中西药有效成分分析，（电子信箱）cchhh2003＠163.com。

2016－08－01)