外周血循环肿瘤细胞的研究进展

范军振吕亚莉宋欣钟梅王琼朱凤伟石怀银(通讯作者)

100853中国人民解放军总医院病理科(北京)

外周血循环肿瘤细胞的研究进展

范军振吕亚莉宋欣钟梅王琼朱凤伟石怀银(通讯作者)

100853中国人民解放军总医院病理科(北京)

目的：外周血循环肿瘤细胞(CTCs)在肿瘤预后评估、疗效评价、肿瘤分期、复发转移检测方面具有重要临床价值。CTCs临床应用的研究主要集中于肿瘤早筛、治疗方案及预后评估、基因分析、体外培养。本文针对CTCs检测方法及临床应用进行综述。

循环肿瘤细胞；液体活检分子；病理；免疫组化

目前恶性肿瘤的确诊及靶向治疗前的检测均依赖于病理活检，但病理活检是依赖于外科手术或影像学引导的有创操作，其操作流程耗时较长，过程繁琐，成本也相对较高。对于疑似病例、部位特殊、体积较小、肿瘤晚期等不易活检的患者，病理活检的应用也受到了一定的限制。多年来，人们一直致力于通过外周血检测肿瘤标记物进行恶性肿瘤的筛查和预后判断，但由于其敏感度和特异度并不理想，其参考意义也受到一定限制。

循环肿瘤细胞定义及性质

循环肿瘤细胞(CTCs)是指从肿瘤患者外周血中检测到的，来源于实体肿瘤逃离宿主免疫杀伤后存活的异质性肿瘤细胞。肿瘤原发灶形成或增长过程中进入外周血循环系统的肿瘤细胞，大部分由于免疫识别机制或者细胞自身未能获得新的生存机制而被清除，只有少量细胞由于发生尚未完全认识的变化而在外周血循环中存活下来，这类细胞即称为CTCs。不仅如此，CTCs还有可能相互聚集，形成微小的多细胞聚集体，这类结构被称为循环肿瘤微栓(CTM)。CTCs和CTM的存在被认为是肿瘤发生复发和转移的重要原因和标志物[1]。

CTCs与上皮-间质转换(EMT)：在CTCs与肿瘤转移的研究中，EMT是一项关键内容，肿瘤在转移过程中会发生上皮型向间质型的转换，在这个过程中细胞上皮标记物(EpCAM)表达量下调，间质标记物(如Vimentin)表达量上调，从而使肿瘤细胞侵袭性增强[2]。虽然目前EMT在CTCs的研究并不充分，但已得到证实：单独依靠上皮标记进行CTCs分离和鉴定，有可能仅捕获那些带有上皮标记的CTCs，而那些与肿瘤转移相关性更高的间质型CTCs可能未被捕获[3]。

CTCs的特性：①稀有性：每克肿瘤每日有大量肿瘤细胞脱落入血，但只有极少数存活，每105～107个有核细胞中才有一个CTCs，每10mL血液中可能仅含有几个到几十个CTCs[4]。②异质性：肿瘤在转移过程中会发生EMT，在这个过程中细胞的上皮标记物表达量下调，间质标记物表达量上调，从而使肿瘤细胞侵袭性增强，蛋白表达具有不稳定性，而且不同实体瘤来源CTCs、不同患者CTCs表面抗原表达、分布也存在差异。③非典型形态：CTCs入血后随血液快速流动，与其他细胞碰撞，受到血管壁的挤压，受机体免疫系统以及药物的攻击，导致CTCs形态有别于肿瘤组织，细胞大小、形态及表型发生改变。

循环肿瘤细胞的分离富集和鉴定

CTCs的分离富集：目前CTCs的富集方法理论依据主要包括两种：①利用CTCs和正常血液细胞在大小、形态等物理学差异以及肿瘤细胞特有的核型等特征分离和鉴定CTCs，这种以细胞大小差异为基础的方法称为ISET方法[5]。②以检测CTCs特异的表面标志物为基本原理，大部分CTCs表达CK、EpCAM等上皮细胞标记，因此可以通过这些特异性标志物进行免疫识别，在此核心原理的基础上结合纳米、微流、磁珠等技术可以实现CTCs的分离和鉴定[6]。由于CTCs的异质性，临床研究表明很多种类肿瘤患者检测到不表达EpCAM等标记的CTCs，因此根据CTCs的表面标志物进行检测可能遗漏了具有转移能力的CTCs，从而降低了其富集率[7]。

CTC的鉴定：循环肿瘤细胞的鉴定方法有很多种，如免疫组化-免疫荧光、Fish、免疫荧光-Fish、抗原抗体的鉴定技术，以及目前的叶酸受体鉴定技术等。免疫荧光标记技术可以同时使用多种荧光染料对目标细胞进行标记[8]。Fish技术鉴定循环肿瘤细胞，采用基于免疫磁珠微粒原理的前处理富集方法及荧光原位杂交原理的肿瘤细胞鉴别方法，用于定量检测恶性肿瘤患者外周血中循环肿瘤细胞[9]。免疫荧光-Fish技术是在Fish技术的基础上，对分离的CTCs进行免疫荧光标记，从而更加准确地鉴定CTCs。当形态学特征中包含肿瘤细胞特征并显示出显型EPCAM+、CK-PE+、DAPI+、CD45-时，细胞被分为CTCs[10]。

循环肿瘤细胞的相关研究方向

CTCs与肿瘤早筛：目前CTCs检测用于早筛实体肿瘤还未有足够的临床数据支持。目前关于CTCs用于早筛的理论依据主要来源于动物模型的研究结果，对乳腺癌小鼠模型进行研究发现，CTCs可以在原发灶形成的早期开始出现[11]。在胰腺癌小鼠模型中，实体瘤形成前存在CTCs进入血液循环。这些动物模型中的发现提示CTCs可能用于肿瘤的早期筛查。Ilie等2014年发表于PLoSOne关于慢性阻塞性肺疾病CTCs的研究便是最有代表性的一项，这项研究中168例COPD患者和77例非COPD对照样本进行CTCs检测，对照组中没有CTCs检出，而168位COPD患者中有5例检出CTCs，后续跟踪发现这5例检出CTCs的患者在1～4年内均通过CT查见肺部结节，且经病理活检诊断为早期肺癌[12]。

CTCs与治疗方案及预后评估：CTCs计数是否能用于临床治疗方案的指导，也是目前的研究方向之一。Smerage等2014年报道了CTCs计数用于临床治疗方案评估的一项临床研究，这项研究中CTCs数量仍表现为一个良好的预后指标，基线和一线化疗21 d后CTCs数量较多的患者，其PFS和OS较差，而基线CTCs数量较少的患者预后较好[13]。

在转移性难治性前列腺癌双盲Ⅲ期临床试验中，CTCs数量与患者基线PSA水平、骨痛、肝脏疾病、血红蛋白以及碱性磷酸酶水平显著关联，并与PSA以及RECIST的变化关联性显著。CTCs超过5个的患者整体总生存期显著缩短。

CTCs与基因分析：目前CTCs在靶向治疗过程中的疗效监控也是一项研究热点，靶向治疗过程中CTCs检出及CTCs群体组成的变化可能用于快速评估靶向治疗过程疗效的动态变化。如2012年Punnoose等发现CTCs可用于评价晚期NSCLC患者接受靶向治疗的预后，同时对患者ctDNA的分析发现，ctDNA的突变检测比CTCs更灵敏，查出的突变结果与肿瘤的突变情况相关。其ALK及EGFR突变情况、ROS1重排与肿瘤组织高度一致[14]，且靶向治疗过程中CTCs检测到的EGFR突变丢失与治疗效果及复发相关。

CTCs与体外培养：以上研究主要基于CTCs的捕获及鉴定，而通过捕获有活性CTCs的微流控技术，使CTCs培养并进行其功能研究是另一个重要的潜在应用方向。培养CTCs获得细胞系可以用于基因测序、药敏实验等一系列研究[15]。但目前CTCs培养的研究尚不够成熟，主要面临两个方面的问题：①CTCs培养条件并不完善，CTCs成功培养的效率目前仍然较低；②CTCs培养依赖于捕获的CTCs数量。这是CTCs培养在临床应用中需要解决的关键问题。

小结

目前关于CTCs的研究主要可以分为两个方向：①CTCs生物学特性的研究；②CTCs在临床应用的研究。CTCs的生物学特性研究的主要内容包括不同类型CTCs(EMT、肿瘤干细胞特征、CTM)的生物学特征、CTCs的来源研究以及CTCs的分子分型的意义。这些方面的研究成果可以为CTCs的临床应用提供理论依据。

对于CTCs在临床应用的研究，其关键点在于CTCs富集和鉴定方法的标准性、可靠性以及高效性。目前临床应用方面的研究结论主要是由CellSearch系统取得。总体而言，CTCs在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌等实体肿瘤中预后评估方面的临床意义已经得到充分的证实，而在临床研究的跟踪指标、治疗方案评估以及肿瘤早筛这三个方面的临床意义尚未明确和充分证实。

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Research progressof circulating tumor cells in peripheralblood

Fan Junzhen,Lv Yali,Song Xin,ZhongMei,WangQiong,Zhu Fengwei,ShiHuaiyin(Correspondingauthor)
DepartmentofPathology,the GeneralHospitalofthe Chinese People's Liberation Army(Beijing City)100853

Circulating tumor cells(CTCs)in peripheralblood played an important role in the evaluation of tumor prognosis,effect evaluation,tumor staging and metastasis detection.The clinical application of CTCs was mainly focused on early screening, treatmentand prognosis evaluation,gene analysis and in vitro culture.This paper reviewed the detectionmethods of CTCs and its clinicalapplication.

Circulating tumor cells;Liquid biopsymolecules;Pathology;Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.7.5