纳豆激酶的研究进展与展望

高泽鑫，何腊平，2*，刘亚兵，高冰，李翠芹，刘涵玉

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州贵阳550025；3.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉430068；4.贵州大学化学与化工学院贵州，贵阳550025）

纳豆激酶的研究进展与展望

高泽鑫1，何腊平1，2*，刘亚兵1，高冰3，李翠芹4，刘涵玉1

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州贵阳550025；3.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉430068；4.贵州大学化学与化工学院贵州，贵阳550025）

纳豆激酶主要是由枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）代谢产生的碱性丝氨酸蛋白酶，因其具有较强的溶栓能力而著称。与其他的大多溶栓剂相比，纳豆激酶具有安全性好、成本低、易吸收、副作用小等优点，因此可用于开发溶栓药物。该文对国内外纳豆激酶的溶栓功效、理化特性、发酵工艺、活性测定、纯化、改性和产品进行了综述，对其当前研究中的关键问题进行分析，并对未来纳豆激酶的研究方向进行了展望。

纳豆激酶；溶栓；理化特性；纯化；改性

纳豆起源于中国的秦汉时期，是传统的发酵食品，在唐朝时期由高僧鉴真东渡时传入日本，根据日本的风土渐渐演变为纳豆，它被认为是日本人长寿的“秘方”，食用历史1 000年以上[1]。纳豆类似中国的发酵豆和豆豉，经枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）发酵而来，日本将纳豆作为调味品和营养食品[2]，而国人主要将豆豉作为调味料食用。日本学者SUM IH等[3]于1987年首次对纳豆及其提取物作了系统研究，最初将酶的提取物添加到纤维蛋白平板上，发现有明显的溶栓作用，并确定其属于具有纤溶活性的激酶。

血栓疾病严重影响着人类的健康，全球每年因患血栓类疾病死亡的人数多达1 200万，中国约有260万[4]，因此溶栓药物的开发成为了研究的热点。目前临床上常见的溶栓药物是链激酶（streptokinase，SK）、尿激酶（urokinase，UK）和组织型纤溶酶原激活剂（tissue-typeplasminogenactivator，t-PA），由于以上药物存在给药痛苦、副作用大、售价较贵、半衰期短的缺点，开发替代药物成为了新的研究方向。具有高效溶栓作用的纳豆激酶（nattokinase，NK）受到了广泛的关注[5]，它可以降低纤维蛋白原、促进催化血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶、增加体内血栓溶解因子的合成的作用[6]。同时由于纳豆激酶具有可口服、安全性高、价格低和纤溶活力强等优势，其开发研究成为近年来溶栓类产品的研究热点[7]，目前国内外研究在纳豆激酶的理化特性及基因工程方面都取得了较大的进展。本文综述了国内外关于纳豆激酶的溶栓功效、理化特性、发酵工艺、活性测定、纯化、改性和产品的相关研究，对当前研究中的一些问题进行分析，并对未来纳豆激酶的研究方向进行了展望。

1 纳豆激酶的研究进展

1.1 溶栓功效

通过大鼠实验发现[9]，静脉注射纳豆激酶的溶血栓活性是血纤维蛋白原溶酶的4倍[8]。经健康人群口服和动物体内实验可知，服用纳豆激酶后，血液中的优球蛋白溶解加快，纤维蛋白降解产物增加。体内溶栓的实验显示，纳豆激酶能够有效减缓血栓的形成，显著减少股动脉的长度及湿质量并有效提高血栓的再通率，显著减少肺内血栓的形成。因此，纳豆激酶拥有较强的体内溶栓作用，且溶栓作用明显高于同等剂量的尿激酶[10]。

据体外实验结果可知，纳豆激酶能间接的将血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，促使纤维蛋白凝块水解，但纳豆激酶没有血纤维蛋白溶酶原激活剂的功能，不能直接将血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，这一点不同于组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶、链激酶[11]。纳豆激酶能使纤溶酶原激活物抑制剂（plasm inogenadivatorinhibitor，PAI）失活，而PAI具有抑制组织纤维蛋白溶酶原激活剂的作用，可见纳豆激酶是通过蛋白水解作用直接溶解纤维蛋白凝块的[12]。

1.2 理化特性

纳豆激酶是枯草芽孢杆菌代谢时产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，为单链多肽结构，无二硫键，溶于水，固态呈淡黄色或白色。纳豆激酶的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）序列由275个氨基酸残基构成，其相对分子质量一般为28 000 u。该酶N末端为丙氨酸，等电点pH为（8.6±0.3）[13]。在室温下，该酶在pH值6.0～12.0的范围内具有很强的纤维蛋白水解能力，最适pH值为8，在酸性条件下会迅速失活。纳豆激酶酶活不易受反复冻融影响，温度达50℃以上时酶活性会逐渐丧失，超过60℃酶迅速失活，其最适温度为45℃。此外金属离子也会影响其活性，Hg2+能使它完全失活，Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+和Mg2+等对其酶活也有抑制作用，而Ca2+和Mg2+对酶活有明显的激活作用[14]。

1.3 活性测定研究

纳豆激酶是一种具有溶栓活性的蛋白酶，其活性测定原理依据于纤维蛋白原溶解系统的生理过程。主要检测方法有：琼脂糖-纤维蛋白原平板法、纤维蛋白原块溶解时间法、四肽底物法[15]、酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbentassay，ELISA）和血清平板法等检测方法，其中使用较为普遍的为琼脂糖-纤维蛋白原平板法及纤维蛋白原块溶解时间法[16]。

琼脂糖-纤维蛋白原平板法操作方便、观察简便、成本低、可同时测多个样品，应用较为普遍，但其测定值易随培养时间、平板厚度的变化而变化，精确度较差；纤维蛋白原块溶解时间法适用于粗酶活力的测定，对测定灵敏度要求较高的样品误差较大，同时不便于多个样品的同时测定；四肽底物法虽操作简单，但不能完全的反应酶活[17]；血清平板法虽能方便快速的同时用于多个样品测定，但吸光度值会受人工血栓制备的影响误差较大；ELISA准确性和特异性较高，但操作繁琐、成本较高[18]。

2 纳豆激酶的发酵工艺

纳豆激酶是微生物代谢产物，只要工程菌活性稳定，工艺成熟即可实现大规模生产。由于NK发酵原料来源广、生产周期短、产量高、价格低廉和易于提取纯化等优势，使其开发前景广阔[19]。与液体发酵相比，固态发酵成本低、酶活力高、酶系丰富、设备操作简单、易于企业扩大化生产且产率高[20]，因此，国内外食品发酵工业化生产普遍采用这种工艺[21]。发酵后的产品不仅可用作食品直接食用，还可以通过进一步的分离纯化，制得不同级别的纳豆激酶产品—纳豆胶囊和纳豆激酶胶囊。目前商业化发酵中采用的纳豆激酶，活性为800～4 000 IU/g。纳豆激酶发酵基质以含水量在50%～70%之间的黄豆为主[22]。此外可通过添加麦芽糖及少量的无机盐，促进纳豆激酶的合成，提高纳豆激酶的含量，或以农副产品为原料降低发酵的成本[23]。

纳豆激酶拥有现在市场上的一些溶栓药物所无法比拟的优势，因此专家学者期望利用它开发为新一代的溶栓剂。国内外有关筛选产纳豆激酶菌株酶活力的报道多数为100～3 000 IU/g，少部分较高纳豆激酶酶活力的报道为3 000～5 000 IU/m L[24-27]。就目前纳豆激酶酶活力不足的研究现状，提高纳豆激酶酶活力对开发新型溶栓药物非常关键。提升纳豆激酶产量常用的方法有：对野生菌种进行大量筛选或诱变，以期得到产酶量高的菌种；优化发酵条件，包括对发酵原料和发酵因素的优化；利用基因工程技术，改造菌种的基因，得到产酶量高的菌种。

3 纳豆激酶的纯化

目前纯化纳豆激酶常用的方法有：盐析、超滤、层析过滤以及凝胶过滤。其中王刚等[28]将发酵液通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-50凝胶过滤层析进行分离纯化，得到酶比活力、纯化倍数、酶活回收率分别为22 388.81U/mg、19倍和42.1%的高纯度纳豆激酶。李睿等[29]采用硫酸铵沉淀和Phenyl Sepharose疏水柱层析分离纯化纳豆激酶NKⅡ粗酶液，得到酶活回收率、纯化倍数、比活力分别为56.51%、17.90倍和48 407.77 IU/mg的高纯度纳豆激酶。CHOID B等[30]通过采用硫酸铵沉淀、超滤浓缩和阴离子交换层析的方法对冬虫夏草中的粗酶进行分离纯化，得到纯化倍数高达86.1倍，回收率为13.7%的纳豆激酶。这些研究大都存在着方法繁琐、回收率较低、不利于保持酶活力和规模化生产等问题。随着现代分离技术的发展，分离技术在发酵产品分离纯化中应用日渐广泛，把新型分离技术应用于纳豆激酶的分离纯化，对科学研究及生产意义重大。如LIU JG等[31]首次报道了使用AOT/异辛烷反胶束从发酵液中提取纳豆激酶，并得到了纯化倍数2.7倍、酶活回收率80%的酶液。3相分配法（threephasepartitioning，TPP）是一种高效的生物分离技术，GARGR等[32]采用该种方法，利用硫酸铵和叔丁醇的组合从粗提取物中沉淀蛋白质，得到了纯化倍数5.6倍，酶活回收率为129.5%的酶液。

4 纳豆激酶的稳定性与改性

由于纳豆激酶属于大分子化合物，所以在保藏过程中容易失活，因而需要找到更好地维持其酶活稳定性的方法。众所周知苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）和异丙氟磷（diisopropyl fluorophosphate，DIFP）对丝氨酸蛋白酶具有强烈的抑制作用[5]。JAOUADIB等[33]研究发现常见的抑制剂如苯丙胺酰氯甲酮（technological pedagogicalcontentknow ledge，TPCK）、对甲苯磺酰赖氨酸氯甲基酮（toluene sulfonyl lysine ketone，TLCK）、胰凝乳蛋白酶烷化剂、苯甲脒和抑肽酶等均未对丝氨酸蛋白酶有明显的抑制效果。碘乙酰胺、亮抑酶肽、二硫代苏糖醇和胃酶抑素A等试剂同样对酶活性几乎没有影响。

由于多数纳豆激酶药物以口服方式，因此要维持其在消化系统中的稳定性，主要需从物理包埋和分子改性上实现。DONG X Y等[34]利用植物甾醇、卵磷脂和甘露醇等为辅料通过正交试验找到最佳的配比，实现封装效率达65.25%并完成了对纳豆激酶的有效包埋。在纳豆激酶中加入蛋白胨、甘油、海藻酸钠和明胶等同样可帮助维持酶活力，并提高其热稳定性或加入煮沸过的小麦提取液、肉汤以及血清蛋白等，可使纳豆激酶在酸性条件下仍能保持一定的酶活[35]。这表明通过化学方法改性也能使NK在胃环境下保持一定的活力，因此可以通过口服达到应有的溶栓效果。常见的纳豆激酶改性一般是建立在对功能基因探究和酶分子结构的基础上。WENGM Z等[36]通过定点诱变构建的单突变体L31I是野生型NK的2倍催化效率，而双突变体T220S/I31L和M 222A/I31L的酶活性有显著增加，其中突变体M 222A/I31L相对于野生型NK的氧化稳定性有显著增强。

5 纳豆激酶类产品

5.1 纳豆激酶药品

现在溶栓药物大多为纤溶酶原激活剂（plasminogen activator，PA）或其类似物，可直接或间接激活纤溶酶原（plasminogen，Pg）变成纤溶酶（plasm in，Pm），从而促进机体血栓的溶解。由溶血栓药物的发展历程，可将其分为四代[37]：第一代以UK和SK为代表，溶血栓效果好，但会出现系统性出血及过敏反应[38]；第二代药物以tPA、葡激酶（straphylokinase，SaK）和NK为代表，与血栓基质有特异亲和力，但是半衰期长，单疗程用量较大；第三代药物以瑞替普酶（reteplase，rPA）、兰替普酶（lanoteplase，NPA）、靶向溶栓剂等为代表，对溶栓效率、特异性等进行了进一步的提升；第四代药物主要是纤溶酶原激活剂抑制剂-1（plasm inogen activator inhibitor-1，PAI-1），通过增加血浆中tPA的浓度，促进溶栓活性，且可口服、价格较低。目前由于多种原因的限制，国内临床用药仍以UK和SK为主，根据当前情况，在第三、四代药物产品还在缓慢进行的时候，更应该务实的对第二代药物，尤其是纳豆激酶产品的深入开发。因纳豆激酶稳定性易受胃酸影响，令酶活力降低，所以应研发抗酸性更强的肠溶型制剂药物。

5.2 纳豆激酶保健品

目前，纳豆激酶类保健品主要可分为胶囊剂和片剂两种，还有个别的颗粒剂。已有10余家大公司生产纳豆激酶类保健品，其中日本生物科研所最早将纳豆激酶投入商业化生产，美国、韩国、台湾地区相继也有大量的纳豆激酶生产厂家。在国家食品药品监督进口保健食品数据库中，并未查到任何国外纳豆激酶类保健食品的批准文号。因此，国外的纳豆激酶类保健食品数年内还不能进入中国市场，对国内产品暂时不会构成威胁。这也显示出了国内对NK没有形成完善、统一、严格的纳豆激酶类保健食品成分标准，缺乏明确的功能指标和感觉评价体系。其次，国内纳豆激酶保健品多以黄豆为主要原料，功能过于单一、发酵活性较低，不利于高活性产品的制备。

5.3 功能性食品

纳豆作为一种与纳豆激酶相关的功能性食品，与现有的临床溶栓药物相比具有许多优点，如安全性好、成本低、疗效久和有效预防血栓产生[39]。纳豆含有大豆的各种营养成分，且营养物质的含量均高于蒸煮的大豆。在其制作中，微生物酶系将大豆蛋白质分解为氨基酸和多肽，蛋白质的消化率由65%提高至80%，更有利于吸收[40]。此外，纳豆还具有抗菌、抗肿瘤、防治骨质疏松、溶解血栓等功能[41]。据统计约90%的日本人将新鲜纳豆作为日常必需食品，还将其列入中小学生营养配餐。在我国，鲜纳豆由于其令人不愉快的臭味不易被消费者接受，这大大阻碍了通过饮食摄入纳豆激酶，降低血栓发病率的措施。因此需开发适合国内消费者口味的纳豆产品，目前通过从传统发酵食品中分离出产纳豆激酶生产菌株，或者将纳豆食品胶囊化来掩盖纳豆的臭味，来解纳豆口感不适问题[42]。在原有纳豆食品的研究基础上，许多科研人员也将纳豆激酶运用到其他的食品中，如UPADHYAY V K等[43]将纳豆激酶作为外源性水解蛋白酶去促进奶酪中的原发性蛋白水解，此过程不仅增加了大部分游离氨基酸的含量，而且这些氨基酸能用作许多分解代谢反应的底物，反过来又改善了奶酪的风味。

6 展望

本文概括了国内外关于纳豆激酶的综合研究，发现纳豆激酶的溶栓抗栓效果和理化特性都有了系统性的研究，并开发了多种纳豆激酶类产品。近年来通过对纳豆激酶菌种的筛选和发酵工艺的改进，提高了纳豆激酶的产量。在工业化生产中，优化了纳豆激酶、口服纳豆冻干粉、纳豆激酶胶囊的分离纯化工艺，丰富和改良了纳豆产品的保健功效；改善了纳豆原有的氨臭味，使其适用中国人的口感。在菌株选育方面，利用现代基因工程技术和诱变育种技术，选育可供大规模生产的优良菌株，提高了产量。纳豆激酶的许多良好的生理调节功能及开发特性，使其受到越来越多的关注，为预防血管栓塞性疾病，解决大多溶栓药物口服性差、价格昂贵、并发症多等问题带来的福音，前景十分广阔。

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Research progress and prospect of nattokinase

GAO Zexin1,HELaping1,2*,LIU Yabing1,GAO Bing3,LICuiqin4,LIU Hanyu1
(1.SchoolofLiquorand Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory ofAgriculturaland Animal Products Store&Processing ofGuizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.College ofBioengineering and Food Science,HubeiUniversity ofTechnology,Wuhan 430068,China;4.SchoolofChemistry and ChemicalEngineering,Guizhou University, Guiyang 550025,China)

Nattokinase is a kind of alkaline serine proteinasemainly from Bacillus subtilis and iswell known for its strong thrombolytic property. Compared w ithmostofother thrombolytic agents,ithasgood safety,low cost,easy absorption,low side effectsand other advantages,which could be developed as a promising agent for thrombosis therapy.In this paper,the thrombolytic efficacy,physicochemical properties,fermentation process, activity determination,purification,modification and products of nattokinase at home and abroad were reviewed.The key issues in the current research of nattokinasewere analyzed,and the future research direction ofnattokinasewasalso prospected.

nattokinase;thrombolysis;physicochem icalproperties;purification;modification

TS262.3

0254-5071（2017）08-0011-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.003

2017-04-25

贵州省重大专项项目子项目（黔科合重大专项字（[2015]6004-5号））；贵州省农业攻关项目（黔科合支撑（[2016]2580号））

高泽鑫（1993-），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物。

*通讯作者：何腊平（1972-），男，教授，博士，研究方向为发酵工程、生物催化与生物转化。