猪瘟病毒抗原表位的研究进展

孙永芳 ， 徐 璐 ， 张乾义 ， 王 琴

(中国兽医药品监察所 ， 北京海淀100081)

猪瘟病毒抗原表位的研究进展

孙永芳 ， 徐 璐 ， 张乾义 ， 王 琴

(中国兽医药品监察所 ， 北京海淀100081)

猪瘟病毒(CSFV)是黄病毒科瘟病毒属成员，为单股正链RNA病毒，病毒核酸长约为12.3 kb，由5′-非编码区(5′-UTR)、一个开放阅读框(ORF)和3′-非编码区(3′-UTR)构成，开放阅读框编码 3 898 个氨基酸的前体蛋白，在合成过程中被病毒自身编码的或宿主细胞内的蛋白酶水解为4种结构蛋白和8种非结构蛋白，迄今为止发现与抗原相关的蛋白有3种，分别为结构蛋白Erns、E2和非结构蛋白NS3。CSFV的主要抗原表位主要分布于结构蛋白Erns、E2，可以刺激机体产生中和抗体；已有研究发现[1]，非结构蛋白NS3也是一种抗原相关蛋白，能够诱导抗体的产生，且在病毒复制及病毒与宿主细胞相互作用中扮演了十分重要的角色。

抗原并不是通过完整的分子来发挥作用的，其功能和特异性往往是通过其抗原表位来实现的，免疫细胞通过识别与结合抗原分子上的抗原表位来启动免疫应答，CSFV抗原相关蛋白中含有多种表位，其中包括与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合，激活淋巴细胞从而引起免疫反应，也包括与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应，因此研究CSFV抗原表位对明确病毒的免疫机制、致病机理以及疫苗的设计具有重要的意义。本文就上述3种相关蛋白表位的研究进展进行阐述，同时对其在疾病诊断、疫苗研发等方面的应用进行了阐述。

1 E2蛋白表位

CSFV E2蛋白位于病毒的囊膜表面，由ORF编码的690(Arg)至1 060(Leu)之间的370个氨基酸残基组成，分子量为51-58 kD，主要以同源二聚体或与E2-E1的异源二聚体形式存在于细胞或病毒粒子表面，靠近E2蛋白N端上游有一段信号肽序列，C端有一段约40个疏水性氨基酸构成的跨膜区(TMR)。在CSFV编码的蛋白中，E2是最不保守的一种蛋白，但却是主要的抗原蛋白，参与病毒的感染过程并诱导机体产生中和抗体。E2蛋白作为CSFV主要保护性抗原，因此大量的表位研究也主要集中在CSFV E2基因上。从1989年Wensvoort等[2]就开始利用制备的13株CSFV特异性单克隆抗体完成了E2蛋白抗原结构域的划分，发现了4个独立的抗原结构域：A、B、C、D。后经van Rijn[3]对E2抗原结构模型的进行预测，确定了这4个区域的位置，发现这些抗原结构域主要位于E2蛋白近N端的1/2部分，处于两个相对独立的抗原结构单位，一个由结构域B和C组成，另一个由高度保守的A构成。2000年Lin等[4]对CSFV Alfort株E2蛋白部分N端(690aa～910aa)进行融合表达，表达产物与单抗WH303进行识别鉴定，确定了一个高度保守的线性表位(829aa～837aa：TAVSPTTLR)，比对发现该位点在CSFV中高度保守，存在于所有CSFV毒株中，但在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和羊边界病毒(BDV)则变异较大，目前已有许多研究者应用该表位进行的疫苗研究[27-30]。刘思国等[5]从氨基酸的抗原性、亲水性和表面可及性等方面应用蛋白分析软件，对CSFV疫苗株E2蛋白抗原表位进行了预测，结合E2蛋白二级结构分析，人工合成两条多肽序列，与多种特异性单抗进行反应以及偶联载体后免疫家兔，发现多肽WKEYNHDLQND(719aa～730aa)具有很好的反应原性和免疫原性，并推测该表位可能是B细胞构象型表位。随着噬菌体肽库的发展，Yu等[6]利用酵母表达的重组CSFV E2蛋白制备单抗，通过筛选靶基因表达文库和噬菌体展示随机肽库，在E2蛋白C端发现一个瘟病毒属保守性的线性表位YYEP(995aa～998aa)，Dong等[7]通过构建表位肽疫苗，通过动物实验也证实了KNKYYEP(992aa～998aa)是CSFV石门株E2蛋白的一个抗原表位。肖昌等[8]利用抗E2蛋白单抗A11淘选噬菌体随机12肽库，发现单抗A11识别抗原表位为TTWKEYSH(717aa～724aa)，位于E2蛋白的N端。Peng等[9]利用单抗HQ06进行淘选噬菌体随机12肽库，发现LFDGTNP(772aa～778aa)是E2蛋白的一个线性B细胞表位。徐和敏等[10]构建CSFV石门株和疫苗株E2基因噬菌体展示多肽库，利用7株单抗进行筛选，发现有3个表位存在高度同源性，其中TAVSPTTLR已经证实为E2蛋白的抗原表位，GGQ(V)VK(887aa～891aa)和PDGLPHY(903aa～909aa)与预测表位一致，推测可能是E2蛋白的潜在抗原表位。目前本实验室应用肽芯片高通量筛选法鉴定特异性单抗的抗原表位，发现筛选结果与徐和敏筛选表位部分重叠，对其表位的精确定位正在进一步鉴定之中。

为了进一步了解E2蛋白的构象表位，确定特殊氨基酸在抗原表位中的作用，van Rijn等[11-12]用点突变的方法将CSFV E2蛋白N端6个半胱氨酸(Cys)替换为丝氨酸(Ser)，利用多种特异性单抗进行反应，发现第693和737位Cys对E2蛋白B和C结构域抗原表位是必需的，第792、818位和856位Cys对A和D区域的抗原表位是必需的。Chang等[13]对CSFV E2蛋白结构域中所有Cys进行了定点突变，构建载体进行表达，发现CSFV E2蛋白的D/A结构域和C端末端分别存在一个构象表位，而且D/A区域中的Cys不仅影响与抗D/A区单抗的结合，还对抗C端蛋白的单抗结合有影响，说明这两个表位之间在空间构象上相邻且相互作用。

2 Erns蛋白表位

Erns糖蛋白是由ORF编码的268(Glu)至494(Ala)之间的227个氨基酸组成，存在9个潜在的糖基化位点，分子量为44～48 kD， Erns没有疏水的跨膜区，通过非共价连接方式与病毒囊膜中的E2-E1二聚体蛋白或以疏水作用力与囊膜脂质层结合在病毒粒子表面[14]，在病毒囊膜上不稳定，是可分泌蛋白，在CSFV感染的细胞上清、组织和血清中均能检测到Erns蛋白。Erns作为CSFV的免疫糖蛋白，也能刺激机体产生中和抗体，被用于抗原表位载体的研究。Langeduk等[15]在CSFV Erns蛋白C端191aa～227aa处发现了一个抗原表位，该表位具有鉴别CSFV、BVDV、BDV的功能，利用该多肽可以对免疫猪和自然感染猪进行鉴别诊断，王钰璇等[16]通过原核表达也证实了该段多肽具有良好的抗原特异性。Lin等[17]通过对CSFV Alort/187株的Erns蛋白进行分段表达，发现位于332aa～412aa、351aa～427aa和376aa～487aa三个重叠区域能够与抗CSFV全血清发生反应，说明这3个区间中存在抗原表位，且涵盖了病毒的保守区和变异区。Meyer等[18]采用点突变和构建重叠Erns肽库的方法，利用抗Erns的单抗筛选表位，发现在CSFV Alfort/187株的一个抗原区域存在3个模拟表位，分别为TNYTCCKLQ(64aa～72aa)，RHEWNKHGW(73aa～81aa)，DPWIQLMNR(88aa～96aa)。到目前为止，人们对Erns蛋白的抗原表位研究较少，这是由于Erns蛋白虽然是一个比较保守的蛋白，但其暴露在囊膜外的部分为易变区，因此Erns抗原表位的差异性较大，没有发现一株抗Erns的单抗能够识别所有的毒株，这为其研究增加了困难。

3 NS3蛋白表位

在不同瘟病毒之间以及同一瘟病毒的不同毒株之间，NS2/3裂解位点的切割程度变化很大，在CSFV中NS2/3呈不完全切割，出现NS2-3和NS3两种形式，研究发现，NS2-3是一种免疫优势蛋白[19]，在感染动物体能均能发现抗NS2-3的抗体，但NS2-3抗体不具有病毒中和活性。已有研究发现[20]，在CSFV 非结构蛋白NS3与NS4A酶切位点附近(2 273aa～2 287aa)存在一个MCH-Ⅰ分子的T细胞表位(ENALLVALF)，该表位能够诱导细胞毒性T细胞(CTL)应答，而且该表位在瘟病毒属中高度保守。此后，Armemgol等[21]在NS2-3上也鉴定了一个T细胞表位，采用人工合成多肽的方法，横跨CSFV 82%的氨基酸序列，进行诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞应答反应，发现有一段肽段(KHKVRNEVMVHWFDD)与CSFV非结构蛋白NS2-3 1 446～1 460位氨基酸残基同源，而且该多肽可以诱导干扰素调节因子-γ(Interferon Regulatory Factor -γ，INF-γ)分泌，INF2-γ能够刺激CD+4T和CD+8T 细胞应答，在融细胞试验中，进一步发现CSFV特异性T淋巴细胞能够融解含有该多肽的靶细胞，这说明该肽段上既存在CSFV特异的辅助性T细胞抗原表位，又含有CTL抗原表位，该表位可作为合成肽疫苗的候选区域，在黄病毒科其他病毒的表位研究中，也发现非结构蛋白NS3上存在T细胞表位，这与CSFV结果一致[22-24]，这为深入了解CSFV NS3蛋白抗原表位提供了依据，也为CSFV新型疫苗的研制提供思路。

4 猪瘟病毒抗原表位的应用

抗原表位是蛋白质抗原性的基础，研究抗原表位对设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子以及新型诊断试剂等具有重要意义，随着抗原表位鉴定技术以及预测方法的不断更新与完善，研究者对CSFV抗原表位研究也逐步深入，使得将表位应用到疫苗研究、病毒诊断以及鉴定特异性抗体等方面成为可能。

4.1 检测诊断 抗原表位是激发免疫反应的基本单元，使用特异性的抗原表位或其复合物作为抗体或细胞因子的检测物，可检测出特异的免疫成分，提高诊断的特异性，而且使用多种特异表位作为检测抗原也可提高诊断方法的敏感性，目前已有许多研究者制备特异性的单抗用于抗原或抗体的检测，而且成果显著。张富强等[25]基于单抗、抗原表位的特异性和噬菌体模拟表位的放大效应，以单抗作为包被抗体，以噬菌体模拟表位为竞争指示剂，以抗M13噬菌体主要蛋白的特异性抗体为检测抗体，建立了用于CSFV抗原检测的竞争ELISA，在76份临床样品检测中，该方法较国际标准抗原捕捉ELISA具有更高的敏感性，可作为CSFV抗原常规检测方法应用。Li等[26]使用pET表达系统将CSFV E2蛋白部分抗原表位和Erns蛋白部分抗原表位作为嵌合蛋白进行原核表达，制备猪瘟抗体胶体金快速检测试纸，用该试纸对免疫后猪血清进行抗体检测，其敏感度为97.0%(65/67),特异性为100%(98/98)，这与商品化ELISA试剂盒检测结果相一致，符合率达93.5%，制备的试纸条能够快速检测免疫CSFV疫苗后猪体内的抗体效价，具有一定的应用价值。Fimme等[27]利用多肽悬浮芯片技术，将CSFV E2蛋白线性表位(TAVSPTTLR)固定在磁珠上，从而来捕捉血清中特异性抗体，使用该方法对87份CSFV阳性血清以及BVDV和BDV阳性血清进行反应，确定含有特异表位的芯片能够与CSFV血清发生特异性反应，而不与其他瘟病毒属进行交叉反应，该方法可用于猪瘟病毒与其他瘟病毒之间的鉴别检测。

4.2 疫苗研究 到目前为止，猪瘟兔化弱毒疫苗接种仍然是控制猪瘟的主要手段，但其惟一的缺陷是无法区分感染动物与免疫动物。随着猪瘟根除计划的推进，许多研究者开始致力于新型猪瘟疫苗的研制。研究者利用保守抗原表位TAVSPTTLR进行了一系列的疫苗研究，将该表位与GST标签进行融合表达[28]或人工合成表位肽并结合载体蛋白[29]来提高表位肽疫苗的免疫原性，免疫动物后均能产生特异性的中和抗体，但不能对动物产生完全保护。此后，Monso[30]和Guo等[31]构建CSFV多表位分枝多肽系统，将E2蛋白的B细胞表位和NS3蛋白的T细胞表位共同连接到一个赖氨酸“树”上形成树状分枝结构，使免疫原性有所提高，但仍不能产生完全保护。Holinka等[32,33]通过转座子筛选方法在CSFV Brescia株E1基因中插入Flag片段使病毒致弱，并以Flag为阳性标记，突变单抗WH303对应表位(TAVSPTTLR)为阴性标记，动物实验结果显示，免疫该标记疫苗后，猪体内产生较高滴度的抗Flag抗体，而改造后疫苗免疫后不产生与TAVSPTTLR表位相应的抗体，并保护猪免受猪瘟强毒的感染，这说明该毒株是一种具有潜力的双标记疫苗，可用于猪瘟病毒的预防和检测。

4.3 其他应用 病毒载体疫苗利用载体容量大的特性，可以研制多联疫苗，实现一针防多病的目的，是新型猪瘟疫苗的主要研究方向，目前用于猪瘟疫苗研究的载体主要包括痘病毒、伪狂犬病病毒、猪腺病毒和牛流行性腹泻病毒等载体，应用这些载体已成功研制出一些疫苗，但往往出现免疫效果不理想，免疫应答迟缓，存在潜在的基因交换的风险等问题，因此研究人员仍在继续寻找合适的载体用于疫苗的研究，Zhu等[34]分别将PRRSV全部ORF5和CSFV E2蛋白部分抗原表位插入到致弱的脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisviruses，EMCV)中，构建重组病毒，其表达产物是部分PRRSV囊膜蛋白GP5和CSFV中和抗原表位与EMCV蛋白相连，免疫小鼠检测产物的免疫原性，发现小鼠可以产生抗PRRSV或抗CSFV的中和抗体，这说明EMCV可以作为一个表达载体或工具用于新型疫苗的研究。Zhang等[35]利用将猪圆环病毒Ⅱ型(porcinecircovirustype2，PCV-2)核心蛋白核定位信号(nuclear location signal，NLS)替换成外源蛋白而形成病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，分别将CSFV T细胞表位(1 446aa～1 460aa)、B细胞表位(693aa～716aa)和两表位相连进行替换，，对重组基因进行杆状病毒表达，间接ELISA和Western-Blot验证抗原表位，免疫小鼠进行免疫原性评估，结果发现三种模拟核心蛋白NLS形成VLPs，并且诱导小鼠产生有效的抗PCV-2和抗CSFV的体液免疫和细胞免疫，从而推测PCV-2 VLPs可用于抗原载体来传递外源表位，并且可制备成多价苗用于新型疫苗的研究。

5 小结

抗原表位作为抗原的重要组成部分，在诱导机体免疫应答中发挥着重要的作用，而表位的确定不仅可以了解有关免疫反应的众多信息，为进一步人工控制免疫反应奠定基础，而且对药物合成、疫苗设计等具有指导意义。近年来，研究者致力于CSFV抗原表位的研究，筛选出多个特异性CSFV表位，这使得为猪瘟疫苗的研发与诊断鉴定提供了理论依据。文章针对近年来CSFV抗原相关蛋白中抗原表位的研究进展进行了阐述，并对其在疾病诊断、疫苗研发等方面的应用进行了介绍，为研究学者深入了解CSFV免疫机理、致病机理及疫苗的研发提供了理论依据，具有一定的参考价值。

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2017-04-11

国家自然科学基金项目(31372434)

孙永芳(1989-)，女，硕士生，从事预防兽医学研究，E-mail:17701023687@163.com

王琴，E-mail：wq551@vip.sina.com

S852.651

A

0529-6005(2017)07-0072-04