褪黑素对卵母细胞成熟和胚胎体外发育影响的研究进展

魏巧莉，房晓欢，曹 慧，李俊杰,2*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2. 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心，河北保定 071001）

褪黑素对卵母细胞成熟和胚胎体外发育影响的研究进展

魏巧莉1，房晓欢1，曹 慧1，李俊杰1,2*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2. 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心，河北保定 071001）

卵母细胞与胚胎体外培养过程中，细胞处于相对高氧环境，常常会由于抗氧化防御不足而导致氧化应激，使细胞在发育过程中积累大量的活性氧（ROS），从而降低卵母细胞及胚胎的体外发育率。褪黑素作为一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂，能显著降低细胞内ROS水平，清除细胞内自由基，改善卵母细胞的体外成熟与胚胎的体外发育历程。本文从褪黑素对卵母细胞成熟、胚胎体外发育、胚胎质量以及褪黑素作用机制等方面进行综述，为褪黑素在体外胚胎生产中的应用提供参考。

卵母细胞；胚胎；褪黑素；抗氧化剂；体外发育

褪黑素（Melatonin，MT）又名N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是色氨酸的衍生物，由哺乳动物松果体合成并分泌的一种吲哚类激素。褪黑素的2个特异性受体：MT1（褪黑素膜受体1）和MT2（褪黑素膜受体2），被证明在细胞的信号转导中起着极为重要的作用。He等[1]研究表明，MT可促进雌二醇的生物合成并抑制孕酮（P4）分泌，提高细胞中类固醇基因CYP19A1的表达。目前已有研究证明，MT对卵母细胞体外成熟及P4、雌激素（E2）具有促进作用且呈现剂量依赖现象[2]。也有实验证明，MT结合卵泡刺激激素（FSH）可促进卵泡的前期发育[3]。另外，MT作为一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂，能显著降低细胞内活性氧（ROS）水平，清除细胞内自由基，改善卵母细胞的体外成熟与胚胎的体外发育历程。可见，MT除具有调节哺乳动物卵巢功能和生殖活性功能外，还是一种有效的自由基清除剂和广谱抗氧化剂，可直接清除细胞中ROS、增加抗氧化酶和谷胱甘肽（GSH）的表达水平与活性，并抑制促氧化酶以减少细胞氧化损伤[4]。近年来，MT在提高体外培养卵母细胞和胚胎发育方面得到了越来越多的证实。因此，本文从MT对卵母细胞成熟、胚胎体外发育、胚胎质量以及褪黑素作用机制等方面加以综述。

1 MT对卵母细胞体外成熟的影响

MT及其代谢衍生物具有强的清除自由基和抗氧化功能，可降低卵母细胞体外成熟过程中因氧化应激造成的脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤[5]。研究表明，与维生素A、维生素C、维生素E和N-乙酰半胱氨酸相比，MT对卵母细胞的成熟更有效[6]。当向体外培养的未成熟卵母细胞的培养液中加入MT时，可促进卵母细胞体外成熟并提高猪孤雌激活胚胎的发育率[7]。Kang等[8]研究发现，在猪卵母细胞成熟培养期间添加10 ng/mL（4.4×10-8mol/L）MT，可促进卵母细胞的减数分裂能力和增加成熟的卵母细胞比例。Tian 等[7]发现，补充适当浓度的MT可促进牛卵母细胞的减数分裂能力和胚胎的发育和质量。在防止卵母细胞老化方面，MT也具有重要功能。研究证实，在体外培养卵母细胞时补充MT可以提高卵母细胞质量及延缓卵母细胞的衰老[9]；Liang等[10]发现，补充MT可明显减少体外老化卵母细胞与异常纺锤体的比例。

卵母细胞的质量是受精成功和重构胚胎发育能力的最重要因素。研究表明，向卵母细胞的成熟培养基中添加MT，不仅可以促进卵母细胞的成熟还能提高胚胎的质量[11]。Lonergan等[12]亦证明胚胎发育率与卵母细胞内在质量有关。因此，体外成熟（IVM）培养条件可能对胚胎的生产会有一定的影响作用，包括对卵母细胞核成熟、卵裂率和囊胚率的影响。另外，MT的加工工艺对其使用效果也会产生一定的影响。Remiao等[13]发现，MT可增加体外胚胎产生，并且用MT制成的脂质-纳米胶囊（Mel-LNC）体外培养卵母细胞，发现MT在降低ROS水平和囊胚凋亡细胞、增加卵裂率和囊胚发育率方面更有效。可见一定浓度的MT在提高卵母细胞的体外成熟、促进细胞的分裂能力、降低卵母细胞的氧化速度、延缓细胞衰老方面具有重要作用。

2 MT对胚胎体外发育的影响

MT不仅对卵母细胞的成熟有促进作用，对体外胚胎的发育同样具有有益的影响[14-15]。在胚胎体外培养过程中，ROS可导致细胞器特别是线粒体损伤，并引起胚胎发育阻断和凋亡。MT可通过消除细胞中自由基而改善胚胎的体外发育[16]。前人研究证明添加MT对小鼠[17]、绵羊[18]、牛[4,16]和猪[8]的体外胚胎生产均具有积极作用。孤雌激活实验表明，培养液中添加50 ng/mL（2.2×10-7mol/L）MT可显著增加卵裂率[8]；Nakano等[19]实验证实，培养液中加入10-7M MT时，发育到2-细胞和4-细胞阶段的孤雌卵母细胞比例显著高于对照组。对体外受精（IVF）实验表明，MT可增强IVF胚胎的发育能力，并可下调早期胚胎卵裂球凋亡比例[8]。有研究证实，当在含有10-9mol/L MT的培养液中培养猪IVF胚胎时，卵裂率和囊胚总细胞数增加[9]。Do[11]对猪体外受精胚胎研究表明，用25 ng/mL[11]MT培养的胚胎囊胚形成率较对照组显著增加。在体细胞核移植试验（SCNT）中，Nakano等[19]证明加入MT可显著降低SCNT胚胎中的ROS水平和细胞凋亡数。另外，MT不仅可以增强囊胚形成速率、减少细胞凋亡、改善猪[14]和牛-克隆胚胎的胚胎质量[15]，而且还可通过特定的MT受体提高牛胚胎发育的效率[4]。上述研究结果进一步证实了MT对胚胎的体外发育具有积极的促进作用，它能够下调早期胚胎的凋亡比率，促进囊胚形成，降低胚胎中ROS水平。

3 MT对胚胎质量的影响

内细胞团（ICM）细胞数量和总细胞数（TCN）及ICM/TCN在囊胚中的比例是评估囊胚质量的标准之一[20]。Su等[15]发现，MT处理的囊胚中的卵裂球、ICM细胞数量和ICM/ TCN的比例明显高于未处理的对照组囊胚。ICM细胞中SOX2基因是一种关键调节基因，对于内细胞团细胞发育十分重要。研究表明，MT作用下SOX2的表达量比对照组细胞显著上调，SOX2基因的表达上调可能提高体细胞核移植胚泡中ICM / TCN的比率[15]。也有实验证明，在IVC期间添加MT（25 ng/mL）增加了囊胚形成率，并且与未接受MT的囊胚相比，补充50 ng/mL MT减少了囊胚中DNA断裂的比例[8]。可见，添加一定浓度的MT不仅能够显著影响胚胎细胞中内细胞团和总细胞数的比率，同时还能够上调胚胎发育关键基因SOX2的表达量，减少DNA断裂的比率，改善胚胎质量。

4 MT对卵母细胞与胚胎体外发育影响的机制

4.1 MT对细胞抗氧化性及细胞ROS水平的影响 在卵母细胞与胚胎的体外培养微环境中，细胞与胚胎暴露于相对“高氧”环境[21]，由于细胞抗氧化防御不足而导致氧化应激，细胞会产生大量的ROS，包括超氧化物阴离子（O2-）、羟基自由基（-OH）和过氧化氢（H2O2）。大量ROS会引起细胞产生氧化应激，且ROS的过度积累可导致异常基因转录和细胞信号传导、细胞膜损伤、细胞周期停滞、大量DNA断裂、线粒体异常、细胞衰老、细胞凋亡或胚胎中的细胞死亡[22]，从而降低细胞活力与体外发育水平。已有研究证实，细胞内积累的氧化损伤和高水平的ROS可导致细胞膜损伤和DNA断裂[23]。ROS不仅对细胞功能（如蛋白质、脂质和核酸组分的损伤）产生负面影响，而且这种损伤可导致线粒体改变及卵裂率降低，最终影响胚胎的体外发育率。此外，卵母细胞中DNA损伤程度与细胞内ROS水平的增加呈正相关。

MT作为一种抗氧化剂，可有效改善体外培养细胞的外环境，提高卵母细胞与胚胎的体外发育率。因此，抑制胚胎或卵母细胞中ROS的产生或添加自由基清除剂可增强胚胎发育潜力。Kang等[8]报道MT处理的卵母细胞IVM过程中ROS水平显著低于未处理的卵母细胞。牛体细胞核移植胚胎的研究表明，MT可显著降低细胞内ROS水平和上调牛抗氧化基因SNT1和Gpx4的表达[15]。在小鼠上，大量研究也证实MT可显著降低IVF胚胎ROS水平，并可促进胚胎的体外发育[20]。Suzuki等[24]在猪胚胎细胞培养基中加入抗氧化剂，结果显示抗氧化剂可减少细胞间H2O2水平并提高了胚胎的发育能力。Nakano等[19]则证实，在IVC期间加入MT可降低孤雌生殖胚胎中ROS的水平。可见MT的存在对体外培养的胚胎及卵母细胞起到了显著降低细胞内ROS水平的作用。

4.2 MT对细胞凋亡的影响 细胞凋亡是指为维持细胞内环境的稳定，由基因控制下的细胞自主有序的死亡，是评价细胞质量的重要标准之一，是评价体外胚胎发育能力的重要因素。研究证实，MT可阻止绵羊颗粒细胞中因热应激引起的增殖减少和凋亡率增加[25]。大量研究证实，MT通过保护细胞免受氧化应激，使线粒体内环境保持稳态，从而减少细胞的凋亡[5,22]。同时MT作为一种抗氧化剂，也可以显著减少体外培养细胞的凋亡，改善胚胎质量。有研究表明，MT的补充可显著减少牛核移植胚胎的凋亡、改善胚胎质量。类似地，MT的处理可减少猪SCNT胚胎和体外培养的鼠胚胎的凋亡。Ren等[26]发现，MT可以补偿受损的谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶（GSH / GPx）系统，减轻胚胎凋亡。MT抗细胞凋亡不仅通过其抗氧化作用，还可通过其调节基因表达的能力。有研究表明，MT可抑制促凋亡基因p53和Bax的表达，并刺激抗氧化基因SOD1和Gpx4、抗凋亡基因BCL2L1和多能性相关基因SOX2在核移植胚胎中的表达[15]。可见，MT能够有效地维持细胞内环境的稳定，降低细胞的氧化应激程度，调节细胞中凋亡相关基因的表达。

4.3 MT对胚胎表观遗传修饰的影响 对于体细胞核移植重构胚，卵母细胞质中的重编程因子将供体核进行新的表观遗传修饰（主要有DNA甲基化、组蛋白乙酰化、X染色体失活、基因印记和端粒维持）来维持体细胞核移植胚胎的发育，供体细胞核的重编程程度是导致核移植胚胎能否发育成正常动物的最重要的因素之一。其中有关DNA甲基化、组蛋白乙酰化与体细胞核移植重编程的前人已进行大量研究，发现组蛋白超乙酰化可诱导染色质重塑，减轻转录抑制，促进各种因子进入核小体，有助于重编程进行[27]。另有研究发现，在体细胞核移植胚胎培养液中加入MT，可显著提高胚胎细胞H3K9乙酰化表达水平，但不影响总体H3K9甲基化、DNA甲基化和DNA羟甲基化水平[15]。目前关于MT对胚胎表观遗传修饰的影响方面的报道并不太多，还有待深入研究。

5 小结与展望

综上，在卵母细胞及胚胎的发育过程中添加适宜浓度的MT可改善卵母细胞质量、促进卵母细胞与胚胎的体外发育、提高囊胚发育率，增加内细胞团比例，减少由于氧化应激而引起的细胞凋亡，改善胚胎质量，维持线粒体内环境稳态，降低细胞内ROS水平，促进E2与P4的生成，降低重构胚在重编程过程中的转录抑制。然而，MT在卵母细胞与胚胎发育过程中的精密调控机制还不得而知，且MT在不同的物种中在细胞发育的不同阶段起到的作用效果是否一致还未可知。关于MT对细胞表观遗传修饰方面的作用机理目前尚不明确，还需要进行深入探索。

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Advances in Ef f ects of Melatonin on the Development of Oocytes and Embryos in vitro

WEI Qiao‐li1, FANG Xiao‐huan1, CAO Hui1, LI Jun‐jie1,2*

(1. College of Animal Science and Technology, Agricultural Unive sity of Hebei, Hebei Baoding 071001, China; 2. Research Center of Cattle and Sheep Embryo Engineering Technique of Hebei, Hebei Baoding 071001, China)

Oxidative stress is often involved in culturing oocytes and embryos in vitro due to a relatively high oxygen environment and inadequate antioxidant defenses. Then large amount of reactive oxygen species (ROS) are accumulated and the rate of oocyte and embryo development in vitro was decreased. As an ef f ective antioxidant and free radical scavenger, melatonin can signif i cantly decrease the intracellular ROS level, remove the intracellular free radicals, and improve the in vitro maturation and in vitro development of oocytes. This review focuses on the ef f ects of melatonin on oocyte maturation, embryo in vitro development, embryo quality and its mechanism in order to further enhance the understanding of melatonin in oocyte and fetal development, and lay the foundation for the application of melatonin in the production of embryos in vitro.

Oocytes; Embryo; Melatonin; Antioxidants; In vitro Development

S814

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-004

2017-04-26；

2017-07-14

河北省科技计划（17226613D）；河北省高等学校科学技术研究项目（ZD2014002）；河北省自然科学基金（C2014204119）

魏巧莉（1992-），女，甘肃兰州人，硕士研究生，主要从事动物繁殖与胚胎工程研究，E-mail:1398696621@ qq.com

*通讯作者：李俊杰，男，博士，教授，E-mail: lijunjie816 @163.com