siVEGF增敏吉西他滨对人膀胱癌小鼠移植瘤的治疗作用

范海涛 冯树强 张 明 田文杰 杨 潇

(吉林大学第二医院泌尿外科,吉林 长春 130041)

siVEGF增敏吉西他滨对人膀胱癌小鼠移植瘤的治疗作用

范海涛 冯树强 张 明 田文杰 杨 潇

(吉林大学第二医院泌尿外科,吉林 长春 130041)

目的 探讨血管内皮生长因子小干扰RNA(siVEGF)增敏吉西他滨(GEM)对人膀胱癌T24细胞株在小鼠膀胱成瘤情况的影响及其对瘤细胞生长的治疗作用。方法 采用细胞移植法分别把经过处理(治疗组)和未经过处理(对照组)的T24细胞接种到小鼠膀胱内，然后用256排极速CT定期检测，并在28 d时处死动物称瘤重量，测定瘤体积，进行组织病理学和细胞学检查。结果 治疗组和对照组的成瘤率分别为40%(6/15)和93%(14/15)，治疗组瘤细胞生长速度明显低于对照组(P<0.05)。两组肿瘤重量和体积比较差异有统计学意义(P<0.05)。组织病理学和细胞学检查结果显示，治疗组移植瘤细胞增殖能力减弱，恶性度下降，瘤细胞生长转移风险降低，而对照组则未出现相应的变化。结论 模拟人的小鼠膀胱癌原位模型更接近人体膀胱肿瘤的微环境和向膀胱腔内生长的特征，故更适合临床膀胱癌的治疗研究。推测靶向基因治疗联合细胞毒药物的化疗策略极有可能为提升目前临床膀胱癌的治疗水平和提高膀胱癌病人的生存率带来帮助。

膀胱肿瘤；基因治疗；细胞毒药物

肿瘤微环境对肿瘤的发生发展有着至关重要的影响。研究膀胱癌的理想动物模型除应与人体膀胱癌在组织结构和生物学行为上相似外，肿瘤还应生长在膀胱腔内(原位生长)〔1,2〕。本实验选用小鼠，把经过血管内皮生长因子小干扰RNA(siVEGF)表达质粒转染并在其内加进细胞毒药物吉西他滨(GEM)的人膀胱癌T24细胞和未经上述处理的人膀胱癌T24细胞分别接种到小鼠膀胱内，通过CT定期检测两种细胞的成瘤情况，通过肿瘤组织标本检测瘤细胞的生物学行为。

1 材料与方法

1.1 一般材料 人膀胱癌细胞T24购于中国科学院上海细胞生物学研究所。siVEGF表达质粒转染的T24细胞株由本实验室构建并传代保存〔3〕。GEM来自江苏豪森药物有限公司。小鼠购于中国医学科学院中国协和医科大学医学实验动物研究所，雌性30只，平均体重(150±72)g，饲养于恒定温度(25℃～27℃)、恒定湿度(40%～50%)的SPF层流室中。

1.2 建立动物模型 按照参考文献〔4〕建立人膀胱癌小鼠原位膀胱肿瘤模型。苯巴比妥钠麻醉(30 mg/kg),无菌条件下8号导尿管通过尿道插入膀胱，100 μl 0.1 mol/L HCl处理后注入100 μl 0.1 mol/L KOH中和，磷酸盐缓冲液冲洗，分别注入经siVEGF表达质粒转染+GEM处理(治疗组)和未经同样处理(对照组)的T24细胞，浓度为每150 μl含1.5×106个细胞的平衡液(HBSS)，在膀胱内保留1 h后分别使小鼠仰卧和左右侧变换体位共4次，30 min/次，以使HBSS液与整个膀胱腔黏膜充分接触，2 h后拔管，备检。

1.3 采用256排极速CT检测小鼠膀胱成瘤情况 小鼠被麻醉后仰卧固定，经导管注入450 μl NaCl，以间距1 mm、层厚1.5 mm扫描成像。

1.4 组织病理学和细胞学检查 对成瘤的21只小鼠在细胞移植后第28天处死并实时解剖，完整剥离出瘤块，用游标卡尺测定肿瘤大小并称重，显微镜观察确认瘤细胞分级和瘤细胞生长浸润状况。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 小鼠成瘤状况 对照组在T24细胞移植后第7天出现肿瘤，而治疗组第13天才检测到肿瘤，第28天时处死所有成瘤小鼠，切取肿瘤称重并计算瘤体积。对照组小鼠肿瘤重量为(3.9±0.7)g，体积(1895±273)mm3；治疗组分别为(2.3±0.6)g，(1 207±148)mm3，两组瘤重和瘤体积比较均有统计学意义(P<0.05)，表明siVEGF和GEM联用对肿瘤生长具有明显的抑制作用。对照组和治疗组的成瘤率分别为93%和40%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 小鼠成瘤模型生长变化 CT检测对照组和治疗组，分别在T24细胞移植后第7天和第13天见到肿瘤结节，随着时间的延后，肿瘤向膀胱腔内生长和向黏膜下浸润现象愈加明显，提示瘤细胞增殖能力逐渐增强，恶性度逐渐增大，这种变化与处死后动物的组织病理学检查结果相吻合。

2.3 细胞学检查 移植的人膀胱癌细胞株T24特征包括有丝分裂相、高核质比和多型核，这些与未移植前的T24细胞几乎一致。以中度分化为主的细胞多向腔内生长，而以低分化为主的细胞则多向黏膜层呈浸润性生长。肿瘤细胞分级(按世界卫生组织标准)：对照组G1级5只，G2级8只，G3级2只；治疗组G1级4只，G2级2只。临床病理分期(按国际抗癌协会标准)：对照组T1期3只，T2期9只，T3期3只；治疗组T1期4只，T2期2只。提示治疗组瘤细胞恶性程度降低，浸润转移能力减弱；而对照组瘤细胞恶性度依旧，其固有的恶性特征——浸润转移的能力没有改变。

3 讨 论

本文按照参考文献〔4〕所述方法步骤建立的小鼠膀胱癌原位动物模型与人体膀胱癌的发生发展过程以及生物学行为大体一致，从原位癌的发生、生长、浸润以及转移的全过程中，可以捕捉到膀胱癌发生发展的一些生物学行为规律，更适合新抗癌制剂治疗效果的客观评价。与非原位模型(例如：皮下移植瘤)相比，原位膀胱癌动物模型能更好地模拟人膀胱癌的生物学行为。随着动物膀胱癌原位模型逐渐成熟，其应用空间也扩大到了药物开发、药物临床试验〔5〕。这为更好地开展动物实验研究奠定了坚实的基础，亦将为推广在临床实际应用提供强有力的实验依据。由于本实验选用小鼠构建的动物原位膀胱肿瘤模型有别于以往的皮下移植瘤，也更优于不具有免疫功能的裸鼠肿瘤模型，故这可能更适合人类膀胱肿瘤的治疗研究。

本研究结果亦显示，动物膀胱癌原位模型能较好地模拟人的膀胱癌生长方式，因此被广泛认为不仅是观察评价抗癌生物制剂和抗癌化学药物的理想方法，而且对进一步阐明人体膀胱癌的生长转移，甚至治疗后复发的机制也有一定帮助。另外，由于膀胱独特的解剖特点，经尿道直接灌注药物治疗膀胱癌的方法是目前公认的优于其他给药途径的方法。这是因为首先给药方便，保留时间易于人为控制，能使药物发挥并达到最佳的治疗效果；其次药物无须穿过血管屏障及肿瘤局部的高组织间隙压力屏障，这大大提高了药物与靶细胞的结合率；最后避免了血液循环系统对药物的稀释和非特异性摄取导致的药量有效浓度递减和可能诱发的损伤性免疫反应。故建立动物小鼠膀胱癌原位模型并进行治疗实验将成为基础与临床研究的重要方面和相互连接的桥梁。

另外，本文数据表明， siVEGF+GEM治疗使人膀胱癌细胞株T24在小鼠膀胱内成瘤率低，生长缓慢，恶性度降低，浸润转移能力减弱，这与以往的单纯基因治疗效果相比〔6,7〕似有更大优势。也许抗血管生成的基因靶向治疗和细胞毒药物的化疗联合治疗方案将为提高目前膀胱癌的治疗水平和病人的5年生存率带来新的帮助〔8,9〕。

1 Giubellino A,Woldemichael GM,Sourbier C,etal.Characterization of two mouse models of metastatic pheochromocytoma using bioluminescence imaging〔J〕.Cancer Lett,2012;316(1):46- 52.

2 Arentsen HC,Hendricksen K,Oosterwijk E,etal.Experimental rat bladder urothelial cell carcinoma models〔J〕.World J Urol,2009;27(3):313- 7.

3 范海涛，杨 潇，郭 航，等.VEGF siRNA和吉西他滨联用对膀胱尿路上皮癌T24细胞株增殖和凋亡的影响〔J〕.中国实验诊断学，2016;20(11):1830- 3.

4 Cozzi PJ,Malhotra S,McAuliffe P,etal.Intravesical oncolytic viral therapy using attenuated,replication- competent herpes simplex viruses G207 and Nv1020 is effective in the treatment of bladder cancer in an orthotopic syngeneic model〔J〕.FASEB J,2001;15(7):1306- 8.

5 Xiao Z，Brown K，Tulip J,etal.Whole bladder photodynamic therapy for orthotopic superficial bladder cancer in rats:a study of intravenous and intravesical administration of photosensitizers〔J〕.J Urol,2003;169(1):352- 6.

6 Hernández V,De LaPena E,Martin MD,etal.External validation and applicability of the EORTC risk tables for non- muscle- invasive bladder cancer〔J〕.World J Urol,2011;29(4):409- 14.

7 Zhang JL,Cheng Q,Zhou Y,etal.Slug is a key mediator of hypoxia induced cadherin switch in HNSCC:Correlations with poor prognosis〔J〕.Oral Oncol,2013;49(11):1043- 50.

8 Khadim MT,Ahmed SA,Khan FA,etal.Evaluation of vascular endothelial growth factors A,C and D as indicators of lymphangiogenesis and angiogenesis in invasive and non- invasive urothelial carcinoma bladder〔J〕.J Pak Med Assoc,2015;65(8):851- 6.

9 Mazzola CR,Chin J.Targeting the VEGF pathway in metastatic bladder cancer〔J〕.Exp Opin Investig Drugs,2015;24(7):913- 27.

〔2017- 05- 11修回〕

(编辑 袁左鸣)

吉林省自然科学基金项目(No.20150101195JC)

张 明(1963- )，男，主任医师，主要从事泌尿系统肿瘤的防治研究。

范海涛(1974- )，男，副教授，博士，主要从事膀胱肿瘤的防治研究。

R737.14

A

1005- 9202(2017)15- 3648- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.004