丹参酮ⅡA磺酸钠对慢性阻塞性肺疾病气道重塑大鼠PPARγ、NF-κB的影响研究

李春陵 朱静雯 王里

(贵州省人民医院干医科，贵州 贵阳 550002)



丹参酮ⅡA磺酸钠对慢性阻塞性肺疾病气道重塑大鼠PPARγ、NF-κB的影响研究

李春陵 朱静雯 王里

(贵州省人民医院干医科，贵州 贵阳 550002)

目的 探讨丹参酮ⅡA磺酸钠对慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重塑大鼠过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、核因子-κB的影响。方法 通过气管内注射脂多糖及吸烟建立COPD气道重塑大鼠模型。健康Wistar大鼠40只，随机分为四组:正常组(n=10)、模型组(n=10)、丹参酮ⅡA磺酸钠治疗组(n=10)、地塞米松治疗组(n=10)，应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测金属基质蛋白酶-2(MMP-2)、金属基质蛋白酶-9(MMP-9)、金属基质蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、金属基质蛋白酶抑制物-2(TIMP-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的含量，以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法以及蛋白免疫印记法(Western-blot法)检测PPARγ、NF-κB mRNA及蛋白质表达水平。结果 与正常组比较，模型组血清MMP-2、MMP-9、 TNF-α、IL-6的含量明显升高，TIMP-1、TIMP-2则明显降低，而且模型组气管组织PPARγmRNA和蛋白质表达水平明显降低，NF-κB mRNA和蛋白质表达水平则明显升高，差异有显著性(均P<0.05)，经予丹参酮ⅡA磺酸钠治疗后，血清MMP-2、MMP-9、 TNF-α、IL-6的含量明显降低，TIMP-1、TIMP-2则明显升高，且模型组气管组织PPARγmRNA和蛋白质表达水平明显升高，NF-κB mRNA和蛋白质表达水平则明显降低，丹参酮ⅡA磺酸钠治疗组与正常组及地塞米松组比较差异无显著性(均P>0.05)。结论 丹参酮ⅡA磺酸钠通过调节PPARγ、NF-κB mRNA及蛋白质的表达水平，抑制气道重塑因子MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、 TNF-α、IL-6水平，防止气道重塑。

丹参酮ⅡA磺酸钠； 慢性阻塞性肺疾病； 气道重塑； 过氧化物酶体增殖物活化受体γ； 核因子-κB

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以不完全可逆性气流受限为特征， 其病理基础为气道壁和肺实质的慢性炎症及结构破坏，最终导致管腔狭窄、 肺气肿形成和进行性气流阻力增加，这一过程称为气道重塑[1]。丹参酮ⅡA磺酸钠是从丹参中分离出二萜醌类化合物丹参酮后经磺化得到的水溶性物质，具有多种药理作用，如抗氧化，抗菌抗炎，降低血液黏度以抑制凝血 、促进纤溶 、抑制血小板聚集 、延长血栓形成及促进血栓溶解作用[2]，是否能抑制COPD气道重塑目前尚不清楚。本研究通过观察丹参酮ⅡA磺酸钠对COPD气道重塑大鼠PPARγ、NF-κB的调节以及相关气道重塑因子的影响研究，为COPD气道重塑的治疗进一步提供新的作用靶点，同时明确丹参酮ⅡA的作用机制，为临床应用提供科学理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康Wistar雄性大鼠40只，清洁级，鼠龄5～6个月，体质量(250±10) g，由贵阳医学院实验动物学部提供，合格证号：SYSK(黔)2002-0001。

1.1.2 药物、试剂及仪器 丹参酮ⅡA磺酸钠(上海第一生化有限公司，批号：H31022558)，地塞米松(国药集团容生制药有限公司，批号：H41020036)，MMP-2、MMP-9，TIMP-1、TIMP-2、TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒(santa cruz公司)， Trizol(Invitroge公司)， Rnasin(Promega公司)，M-MLV(Promega公司)，引物由上海生物工程公司合成，小鼠抗NF-κB p65 mcAb(Santa Crus公司)，小鼠抗PPARγ(Santa Crus公司)，ECL显影试剂盒(Santa Cruz 公司)，制胶、电泳及转膜仪(Bio-Rad公司)，PCR仪(Eppendorf 公司)，酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 COPD 气道重塑模型制备 采用两次气管内注射小剂量脂多糖及被动吸烟的复合刺激法建立大鼠COPD气道重塑模型：分别于实验第1天和第14天于气管内注入脂多糖200 μg ，第2～28天(第14天除外)将大鼠置于80 cm×60 cm×50 cm大小的有机玻璃熏箱内被动吸烟，每日熏烟2次，每次20支香烟，时间持续1 h，两次熏烟时间间隔4 h。

1.2.2 动物分组及治疗 选用Wistar雄性大鼠40只，随机分组为a.正常组，b.对照组，c.丹参酮ⅡA磺酸钠治疗组(中药组)，d.地塞米松治疗组(西药组)，每组10只。b、c、d组按照上述方法造模，模型成功后， c组予腹腔注射丹参酮ⅡA 32 mg/kg.d治疗(丹参酮ⅡA加生理盐水总量至1 mL)，d组予腹腔注射地塞米松0.5 mg/(kg·d)治疗(地塞米松加生理盐水总量至1 mL)，正常组及对照组以生理盐水1 mL腹腔注射，共治疗14 d。

1.2.3 检测标本获取 实验结束后，将大鼠股动脉放血处死，所收血液置于无菌带塞试管中，不抗凝，3 000 r/min离心10 min，分离血清，处理后贮藏于-30 ℃ 低温冰箱保存；取实验动物左、右主支气管分叉以上约5 mm 的气管组织，贮藏于-70 ℃ 超低温冰箱保存。

1.2.4 气道重塑相关因子含量检测 采用ELISA法测定MMP-2、MMP-9，TIMP-1、TIMP-2、TNF-α、IL-6的含量，操作过程参照试剂盒说明进行。

1.2.5 气管组织PPARγ、NF-κB mRNA的表达 PPARγ引物：sense5’ TCAAGGGTGC CAGTTTCG 3’，antisense5’CAGCAGGTTGTCTTGGATGT 3’，产物大小397 bp。NF-κB引物：sense5’ TTGTCCCGCCCCTTAGCC 3’，antisense5’ TCCTCCCTTTCCTTGTCC 3’，产物大小401 bp。内参基因(GAPDH)：sense 5’ TCATGTTTGAGACCTTCAA 3’，antisense 5’GTCTTTGCGGATGTCCACG 3’， 产物大小512 bp。按TRIZOL试剂说明书提取气管组织总RNA，参照第一链cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录反应，然后进行PCR反应。取PCR产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳、照相，利用UVP凝胶扫描仪测定条带的吸光度(A)值，以目的基因与GAPDH条带的吸光度(A)值的比值代表其表达的相对量。

1.2.6 气管组织PPARγ、NF-κB蛋白质的表达 提取气管组织蛋白质，制备聚丙烯酰胺凝胶、蛋白电泳、转膜。一抗浓度均为1∶1 000，二抗浓度为1∶2 000，化学发光试剂法曝光、显影和定影，凝胶成像分析系统进行密度扫描并分析。

2 结 果

2.1 气道重塑相关因子含量检测 与正常组比较，模型组血清MMP-2、MMP-9、 TNF-α、IL-6含量与正常组比较明显升高，TIMP-1、TIMP-2含量则明显降低(P<0.05)；丹参酮 ⅡA磺酸钠治疗组、地塞米松治疗组上述指标与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；丹参酮 ⅡA磺酸钠治疗组上述指标与地塞米松治疗组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组气道重塑相关因子含量检测

注:与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.2 气管组织PPARγ、NF-κB mRNA和蛋白质表达水平的检测 与正常组比较，模型组气管组织PPARγmRNA和蛋白质表达水平明显降低，NF-κB mRNA和蛋白质表达水平则明显升高，有显著性差异(均P<0.05)；丹参酮 ⅡA磺酸钠治疗组、地塞米松治疗组上述指标与正常组比较，无显著性差异(均P>0.05)；丹参酮 ⅡA磺酸钠治疗组上述指标与地塞米松治疗组比较，无显著性差异(均P>0.05)。结果见表2，气管组织PPARγ、NF-κB mRNA 表达的琼脂糖电泳图和聚丙烯酰胺凝胶蛋白质电泳图，见图1～4。

表2 各组气管PPARγ、NF-κB mRNA和蛋白质的表达水平相对量]

注:与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

3 讨 论

PPARγ是一种配体活化的转录因子，配体与之结合后调节靶基因的转录，调控多种细胞功能和病理生理过程[3]。PPARγ除表达于脂肪细胞、血管壁外， 还广泛分布于气道上皮、ASMC、支气管黏膜下层、肺上皮细胞、免疫细胞( 如单核细胞、巨噬细胞、T 细胞、B 细胞、树突状细胞、中性粒细胞等)4]。近年来研究[5-6]发现，PPARγ可通过NF-κB、活化蛋白1(AP-1)、信号转导和转录活化因子(STAT)信号通路抑制IL-6、内皮素-1、一氧化氮合酶、基质金属蛋白酶(MMP)9、粘附分子表达，抑制气道炎性反应、气道重塑。

本研究发现，模型组血清MMP-2、MMP-9、 TNF-α、IL-6的含量与正常组比较明显升高，TIMP-1、TIMP-2则明显降低，而且模型组气管组织PPARγmRNA和蛋白质表达水平明显降低，NF-κB mRNA和蛋白质表达水平则明显升高。提示PPARγ和NF-κB通过影响气道重塑因子MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、 TNF-α、IL-6的含量参与COPD气道重塑形成。目前干预气道重塑的病理生理过程，肾上腺皮质激素具有一定效果，但长期应用激素治疗COPD一直存在着较大争议，对于激素治疗后COPD患者的气道和肺的病理改变仍在进一步研究中，特别是老年患者存在多种基础疾病，不适宜长期使用激素治疗。本研究发现，予丹参酮ⅡA磺酸钠治疗后，气道重塑大鼠血清MMP-2、MMP-9、 TNF-α、IL-6的含量与正常组比较明显降低，TIMP-1、TIMP-2则明显升高，且模型组气管组织PPARγmRNA和蛋白质表达水平明显升高，NF-κB mRNA和蛋白质表达水平则明显降低，与正常组及地塞米松组比较差异无显著性。

丹参为唇形科鼠尾草属植物，其根入药，入心肝二经，中医认为丹参具有行气、益气、活血、养血之功。丹参酮ⅡA磺酸钠是从丹参中分离出二萜醌类化合物丹参酮后经磺化得到的水溶性物质，能够抑制人脐静脉内皮细胞迁移及血管形成，其机制可能与丹参酮 ⅡA 剂量依赖性降低内皮细胞 MMP-2活性、促使血管内皮细胞MMP-2的分泌减少、TIMP分泌增多有关[7]，丹参酮 ⅡA 还能够抑制TGF-β1 诱导的细胞增殖及分泌Ⅰ型胶原，防止肾纤维化[8]，在抑制组织重塑、凋亡、血管新生等方面具有一定作用[9]。综上所述，丹参酮ⅡA磺酸钠通过上调PPARγmRNA及蛋白质的表达水平，下调NF-κB mRNA和蛋白质表达水平，抑制气道重塑因子MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、 TNF-α、IL-6水平，防止气道重塑，为进一步临床应用提供理论依据。

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Study on influence of Tanshione ⅡA on PPARγ and NF-κB in the airway remodeling of rat with COPD

LiChunling,ZhuJingwen,WangLi.

DepartmentofMedicineforCadre,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,China.

Objective To investigate the influence of Tanshione ⅡA on PPARγ and NF-κB in the airway remodeling of rat with COPD. Methods The model of airway remodeling of rat with COPD was established by intratracheal injection of lipopolysaccharide combined with cigarette smoking. 40 healthy Wistar rats were randomly separated into 4 groups which were normal control group, model control group, Tanshione ⅡA treatment group and dexamethasone treatment group (10 rats in each group). Levels of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α and IL-6 were measured by ELISA, mRNA and protein levels of PPARγ and NF-κB were evaluated with RT-PCR and western-blot (WB) respectively. Results In model control group, levels of MMP-2, MMP-9, TNF-α and IL-6 were significantly higher, also mRNA and protein levels of NF-κB up-regulated, but levels of TIMP-1, TIMP-2 and mRNA and protein levels of PPARγ were significantly lower than those in normal control group, and there were no statistical significantly differences (allP<0.05). But these change could be attenuated by Tanshione ⅡA treatment group, compared with normal control group and dexamethasone treatment group, there were no statistical significantly differences in Tanshione ⅡA treatment group (allP>0.05). Conclusion Tanshione ⅡA may reverse the airway remodeling through PPARγ and NF-κB regulating MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α and IL-6.

Tanshione ⅡA； COPD； Airway remodeling； PPARγ； NF-κB

贵州省中医药管理局、民族医药科学技术研究课题(编号：QZYY2013-84)

R-332,R563

A

1000-744X(2016)05-0466-03

2015-12-21)