大鼠miR-24腺病毒载体构建和鉴定

杨 简 范致星 杨 俊 丁家望 杨超君 曾 萍

(三峡大学心血管病研究所 三峡大学第一临床医学院心内科，湖北 宜昌 443003)

大鼠miR-24腺病毒载体构建和鉴定

杨 简 范致星 杨 俊 丁家望 杨超君 曾 萍

(三峡大学心血管病研究所 三峡大学第一临床医学院心内科，湖北 宜昌 443003)

目的构建含miR-24基因的重组腺病毒，为后期研究miR-24在大鼠颈动脉球囊损伤所致血管再狭窄(RS)中的作用及分子机制奠定基础。方法PCR钓取目的基因miR-24，连接入穿梭载体GV139。采用AdMax腺病毒包装系统，将构建的miR-24重组腺病毒穿梭质粒与辅助包装质粒(PBHG)共转染HEK293细胞，通过Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组，得到重组腺病毒，并进行重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定。结果成功构建了大鼠miR-24腺病毒载体，滴度为1×109PFU/ml。结论成功获得含miR-24基因的重组腺病毒，为后期顺利开展有关miR-24在血管RS中的作用及分子机制研究提供了可能。

miR-24；腺病毒；载体；颈动脉；球囊损伤；再狭窄

miRs是一类高度保守的内源性非编码小分子RNA，22～25个核苷酸。其通过与靶基因3’端非翻译区(3’-UTR)互补配对结合，使靶mRNA降解或翻译抑制，从而来调节细胞增殖、分化和凋亡等一系列生理进程〔1〕。研究表明不同血管特异性miRs 如miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-205、miR-92a、miR-145等通过调节各自的靶mRNA，参与调控损伤血管再狭窄(RS)的病理生理过程或者发挥保护效应〔2～5〕。miR-24在机体内含量的改变与病理性血管新生内膜的形成有着密切的关系〔6〕。但有关miR-24在血管RS这一病理过程中的作用及其调控机制鲜见报道。本研究旨在通过miR-24腺病毒载体的构建、鉴定，腺病毒的包装、扩增、纯化等实验过程，获得具有一定滴度含miR-24基因的重组腺病毒，为后期研究miR-24在血管损伤所致RS中的作用及分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1大鼠miR-24穿梭质粒的构建和鉴定 应用Primer5.0引物设计软件设计含AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切位点的引物，该引物同时含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因，引物序列正义链：5′-AGGTCGACTCTAGAGGATCCGAAATCTTGAATGCAGTAGGC-3′，反义链：5′-GGAGGGAGAGGGGCGGATCCCTCTGCACTCTATTCAATG-3′。PCR反应条件：98℃ 5 min；98℃ 10 s；55℃ 10 s；72℃ 30 s；30个循环；72℃ 8 min。对钓取的目的基因产物进行AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切。用AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切腺病毒载体GV139以使其线性化，并与同样被酶切的目的基因进行连接。将连接好的产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，对长出的克隆进行酶切鉴定和测序比对。

1.2腺病毒载体的包装 本实验用质粒抽提试剂盒提取构建的miR-24穿梭质粒DNA和辅助包装质粒pBHG loxΔE 1,3 Cre DNA，将提取的质粒DNA 溶于除菌的TE缓冲液中，且保证A260/A280在1.8～2.0。将制备的质粒DNA 5 μg加入一灭菌的离心管中并用DMEM混合均匀(共50 μl)，在室温下温育5 min。另取10 μl脂质体2000试剂与50 μl DMEM 混合，同样室温下温育5 min。把上述两种稀释液进行混合，在室温下温育20 min，形成转染复合物。将转染复合物转染至人胚肾293细胞培养液中混匀、培养。6 h后倒去培养液，加入含10% 血清的细胞培养液5 ml，继续培养。显微镜下观察，若细胞出现病变、脱壁等现象，提示包装成功。收集上清液(粗提液)，-70℃保存备用。

1.3重组腺病毒的扩增和纯化及滴度测定 第1轮扩增：将人胚肾293细胞传入T25细胞培养瓶中，待60%融合时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入粗提液2 ml，于培养箱中孵育90 min，最后再补加完全培养液3 ml并继续培养。待出现典型的细胞病变、细胞脱壁时，收集病毒上清液于-70℃保存。第2轮扩增：将人胚肾293 细胞传入T25 细胞培养瓶中，待90%融合时，弃去旧培养液，加入首轮扩增的病毒液2 ml，置于培养箱中孵育90 min，最后补加完全培养液10 ml并继续培养。待出现典型的细胞病变、细胞脱壁时，收集病毒上清液于-70℃保存。将第2轮扩增的病毒上清液按相关步骤进行纯化〔7〕，并感染人胚肾293细胞，以终点稀释法计算滴度值。

2 结 果

2.1阳性克隆的鉴定与测序 PCR钓取的目的基因miR-24经过交换、经转化后，行菌落PCR的鉴定，其结果与预期相符。重组阳性克隆测序，序列全部测通，miR-24穿梭质粒构建成功。

2.2腺病毒载体包装的结果 miR-24穿梭质粒和腺病毒包装质粒共转染人胚肾293细胞大约10 d后，观测到细胞出现典型的细胞病变，提示腺病毒包装成功。

2.3重组腺病毒扩增和纯化及滴度测定的结果 两轮扩增时，大部分细胞都出现了典型的细胞病变及脱壁现象。对病毒浓缩液滴度测定，显示病毒滴度为1×109PFU/ml。

3 讨 论

介入治疗、冠脉搭桥手术是冠心病目前主要的治疗方式〔8〕。然而，冠脉支架术后限制了其远期疗效，药物涂层支架也没有从根本意义上消除RS〔9〕。目前认为RS 形成原因有：扩张的球囊对血管壁的直接损伤；多种炎症因子、细胞生长因子的释放；原癌基因的异常表达和调节细胞周期的蛋白质合成〔10〕。miRs广泛存在于真核细胞中，能通过降解靶mRNA或抑制其翻译，调节细胞增殖、分化与凋亡〔11〕。研究表明，机体内miRs的改变与很多心血管疾病的发生发展密切相关，这其中就包含了冠脉支架术后RS〔12〕。但有关miR-24在血管RS这一病理过程中所起作用的报道并不多。若能弄清miR-24在RS中的作用及分子机制，将可能为冠脉支架术后RS的有效治疗提供新思路。腺病毒可感染分裂和非分裂细胞，具有转基因效率高、病毒滴度高、安全性好、外源性基因目的蛋白表达水平高、病毒基因组不整合宿主染色体等多项优点，成为目前最具前景的载体之一〔13〕。

1van Rooij E.The art of microRNA research〔J〕.Circ Res,2011;108(2):219-34.

2Ling S,Nanhwan M,Qian J,etal.Modulation of microRNAs in hypertension-induced arterial remodeling through the β1 and β3-adrenoreceptor pathways〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2013;65(12):127-36.

3Kaluza D,Kroll J,Gesierich S,etal.Histone deacetylase 9 promotes angiogenesis by targeting the antiangiogenic microRNA-17-92 cluster in endothelial cells〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013;33(3):533-43.

4Rippe C,Blimline M,Magerko KA,etal.MicroRNA changes in human arterial endothelial cells with senescence:relation to apoptosis,eNOS and inflammation〔J〕.Exp Gerontol,2012;47(1):45-51.

5Rangrez AY,Massy ZA,Metzinger-Le Meuth V,etal.miR-143 and miR-145:molecular keys to switch the phenotype of vascular smooth muscle cells〔J〕.Circ Cardiovasc Genet,2011;4(2):197-205.

6Ji R,Cheng Y,Yue J,etal.MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation〔J〕.Circ Res,2007;100(11):1579-88.

7范致星，杨 简，杨 俊,等.大鼠微小RNA-22腺病毒载体的构建和鉴定〔J〕.中华老年心脑血管病杂志,2014;16(8):853-5.

8Mavromatis K,Samady H,King SB.Revascularization in patients with diabetes:PCI or CABG or none at all〔J〕.Curr Cardiol Rep,2015;17(3):565.

9Costa MA,Simon DL.Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents〔J〕.Circulation,2005;111(17):2257-73.

10Curcio A,Torella D,Indolfi C.Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and endothelial regeneration after vascular injury and stenting:approach to therapy〔J〕.Circ J,2011;75(6):1287-96.

11He L,Hannon GJ.MicroRNAs:small RNAs with a big role in gene regulation〔J〕.Nat Rev Genet,2004;5(7):522-31.

12Fan ZX,Yang J.Microribonucleic acids and vascular restenosis〔J〕.Saudi Med J,2014;35(8):796-801.

13Ganeshan DM,Bhosale P,Munden RF,etal.Diaphragmatic hernia after esophagectomy for esophageal malignancy〔J〕.J Thorac Imaging,2013;28(5):308-14.

〔2016-06-24修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

国家自然科学基金资助项目(No.81170133，81200088，81470387)；三峡大学硕士学位论文培优基金(No.2015PY052)

杨 简(1982-)，男，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事心血管疾病临床及基础研究。

R714.252

A

1005-9202(2017)17-4175-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.003