创伤性脑损伤大鼠ERK-MAPK 信号传导途径的动态变化及意义

刘宝华 刘 梅 刘海波 谷 玥

(吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

创伤性脑损伤大鼠ERK-MAPK 信号传导途径的动态变化及意义

刘宝华 刘 梅1刘海波 谷 玥

(吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

目的探讨大鼠创伤性脑损伤(TBI)急性期脑皮质神经细胞细胞外调节蛋白激酶(ERK)-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的动态变化及意义。方法将实验大鼠通过外力导致TBI，脑损伤后皮层下微量注射ERK-MAPK信号传导抑制剂。通过Western印迹检测pERK在大脑各部位的表达水平，末端脱氧核苷酸转移酸(TUNEL)荧光法检测神经细胞凋亡。结果Western印迹法检测脑损伤后1、6 h，1、3、5 d时pERK表达，发现TBI组pERK在伤后1 h起迅速升高，3 d时为最高，损伤后5 d仍高于对照组。TBI+SCH772984组pERK水平较同时间段TBI组减少(P<0.01)。TUNEL法发现TBI+ SCH772984组损伤处检测凋亡细胞明显少于对照组(P<0.05)，其中TBI+SCH 50mg组降低程度最明显(P<0.01)。结论TBI后出现了高水平的ERK-MAPK信号通路激活，用抑制剂SCH772984对ERK-MAPK信号通路进行抑制，可以保护神经细胞，避免凋亡。

创伤性脑损伤;丝裂原活化蛋白激酶;信号传导

创伤性脑损伤(TBI)是指由于创伤形成时造成的神经细胞直接死亡，机制尚未明确〔1〕。二次损伤的主要机制可能是由于TBI后出现了大量的细胞凋亡。神经细胞的大量凋亡与多种细胞信号传导通路有关，其中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路被认为是导致细胞凋亡的共同通路，其细胞外信号传导通路主要，包括细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2，c-Jun氨基末端激酶(JNK)1/2和P38 MAPK通路。相关研究发现，其中的ERK-MAPK通路调节多种细胞功能，包括细胞生长、增殖、分化和凋亡，可能参与了继发性脑损伤病变过程并对疾病发展进行了调控〔2〕。本研究探讨TBI急性期ERK1/2 通路信号传导途径的动态变化及意义。

1 材料与方法

1.1动物与分组 选择健康SD大鼠105只，雌雄均可，200～250 g。来源于吉林大学基础医学院，并由实验动物中心自然饲养。将其随机分为Sham组、TBI组和ERK-MAPK通路抑制剂组。TBI组和抑制剂组各分为伤后1、6 h、1、3、5 d共5个时间点，每个时间点5只。①Sham组5只：仅作头皮切口，手术操作与其他组相同，但开颅后不给予重力冲击致伤。②TBI组25只：术前30 min仅局部注射盐水;③TBI+ SCH772984 10 mg/kg(PD5)组25只;④TBI+ SCH772984 25 mg/kg(PD10)组25只;⑤TBI+ SCH772984 50 mg/kg(PD20)组25只。

1.2大鼠TBI模型的建立 SD大鼠按体重用2%戊巴比妥钠药物50 mg/kg麻醉，定位仪上固定。分离头皮至骨膜，露出顶骨。进行颅骨钻孔，直径4～5 mm，注意不伤到硬脑膜。按照Feeney法做出大鼠TBI模型，在左顶骨钻孔部的硬脑膜处放置底座，用50 g重物从30 cm高处自由落体下落，自由落体冲击力为50 g×30 cm，形成左顶叶脑损伤。

1.3ERK-MAPK信号传导抑制剂的应用 由骨窗插入海马背侧上缘，挫伤灶皮层下2.5 mm插入金属微导管尖端，采用渗压性微量注射泵(Alzet-1003D，美国Alza公司)注射。抑制剂组伤后即刻将SCH772984(美国Selleck公司)加入5 μl生理盐水中10 min内注射，而TBI组仅注射生理盐水。

1.4Western印迹法检测各组脑组织内ERK表达 实验大鼠在对应时间点，以水合氯醛进行麻醉，处死后切取各部位皮层。将脑组织剪碎，加入细胞裂解液，冰浴混匀，高速离心。测定蛋白浓度后加入缓冲液，煮沸后离心。取沉淀物30 μg进行电泳，然后从10%聚丙烯酰胺凝胶将目的蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，观察转移效果。根据标准分子量蛋白对照，确定含有待测蛋白条带位置。磷酸盐缓冲液(PBS)封闭，加入多克隆抗体(兔抗人ERK)。加入辣根过氧化物酶IgG抗体(羊抗兔)。随后发光剂洗涤，暗室曝光。测定吸光度值。并测定待测蛋白相对浓度。

1.5末端脱氧核苷酸转移酶(TUNEL)法检测各组细胞凋亡 分别在伤灶中心皮质、白质和相应部位脑组织取材，根据细胞凋亡检测试剂盒说明书，光镜下检测细胞染色。每个切片各计数10个400倍视野，计算神经细胞凋亡指数(AI)，即平均每100个神经细胞中所含凋亡细胞数。

1.6检测caspase-3蛋白的表达 按照SDS-PAGE电泳技术以及固相免疫测定法进行测定：取损伤处皮质、白质以及相应部位脑组织，剪碎组织后随即加入细胞裂解液，提取蛋白质，电泳后转膜。将硝酸纤维素膜中和后，分别与兔抗小鼠caspase-3一抗和生物素标记羊抗兔二抗IgG反应，通过辣根过氧化酶混合，最后二氨基联苯胺(DAB)显色。

1.7统计学方法 应用SPSS16.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组ERK蛋白在TBI组织内的表达 各组ERK蛋白表达水平在TBI后显著升高。而TBI后SCH抑制剂组与TBI组比较降低显著(P<0.01)，而且SCH 50 mg/kg组低于10 mg/kg组(P<0.05)。

2.2SCH772984对TBI后细胞凋亡的影响 通过荧光显微镜进行观察，发出绿色荧光者为TUNEL阳性细胞，凋亡细胞核表现为双重荧光。TBI后1 h～5 d Sham组少量细胞凋亡。TBI组坏死细胞片状分布，位于伤灶中心皮质；而凋亡细胞散在分布于皮层、皮层下白质。TBI组较Sham组AI明显升高(P<0.01)，而TBI+SCH抑制剂各组较TBI组显著降低(P<0.05)，其中TBI+SCH 50 mg组降低程度更大(P<0.01)。

2.3TBI后各组caspase-3蛋白表达的变化 伤后1 h伤灶皮层下白质和海马就出现了caspase-3表达条带，并持续到5 d；而Sham组以及抑制物组脑组织均未出现caspase-3表达带谱。通过密度分析显示，Sham组仅有少量caspase-3蛋白表达，而在TBI组伤后1 h伤灶皮层及白质的caspase-3蛋白表达就开始增加，48 h达到最高，之后缓慢下降，到5 d时仍比对照组高(P<0.05)。其中伤后24 h伤侧海马区caspase-3蛋白表达增加1 324%，伤后48 h伤灶皮层下白质区增加1 690%。抑制剂组caspase-3蛋白谱密度明显下降(P<0.05或P<0.01)。

2.4相关性分析 伤后pERK1/2在脑组织内表达与神经细胞凋亡呈正相关(r=0.925，P<0.05)，95%CI为0.732～0.995，同时发现caspase-3蛋白的表达随着ERK表达的升高而升高(r=0.981，P<0.01)，95%CI为0.731～0.998。

3 讨 论

TBI通常为闭合性脑损伤，具有较高的死亡率和致残率，包括原发性损伤及继发性损伤两个发展阶段。原发性损伤发生时神经细胞会迅速死亡。而继发性脑损伤引起神经细胞凋亡时间较长，在信号传导通路过程中可以通过靶点来进行调节〔3〕。急性期TBI治疗的原则在于尽可能减轻继发性脑损伤的伤害。继发性脑损伤的病理过程非常复杂，包括各种调节介质及细胞因子释放，并通过细胞信号传导通路导致其激活，最后导致细胞凋亡。细胞信号传导是造成这些病理变化的必经之路，因此从细胞信号传导通路来下调过度的细胞凋亡反应可能会提供新的TBI治疗思路。有文献提出 TBI 后ERK-MAPK通路不同程度地出现激活，提示 该通路对于 TBI 后的细胞损伤和修复过程产生影响〔4〕。ERK通路也同样参与TBI的病理生理改变中。pERK1/2激活后从细胞质转移至细胞核，从而调节基因的表达，影响细胞的生存和功能。其中ERK1/2是信号传导通路的关键，ERK蛋白质表达高低可反映ERK-MAPK信号传导通路的激活水平的高低。本研究提示ERK通路抑制剂可以抑制慢性神经细胞凋亡，保护神经细胞，避免二次损伤。

1Armstead WM,Riley J,Vavilala MS.Norepinephrine protects cerebral autoregulation and reduces hippocampal necrosis after traumatic brain injury via blockade of ERK MAPK and IL-6 in juvenile pigs〔J〕.J Neurotrauma,2016;33(19):1761-7.

2Kovalska M,Kovalska L,Pavlikova M,etal.Intracellular signaling MAPK pathway after cerebral ischemia-reperfusion injury〔J〕.Neurochem Res,2012;37(7):1568-77.

3Wei L,Zhang Y,Yang C,etal.Neuroprotective effects of ebselen in traumatic brain injury model:involvement of nitric oxide and p38 mitogen-activated protein kinase signalling pathway〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol,2014;41(2):134-8.

4吴思荣,惠国桢,李向东,等.大鼠创伤性脑损伤后神经细胞凋亡的动态变化及其与caspase-3基因表达的关系〔J〕.中华急诊医学杂志,2009;18(4):361-6.

〔2016-10-21修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

北京协和医学基金会“睿意基金”急诊医学研究专项基金(No.R2015024)

谷 玥(1977-)，女，硕士，副主任护师，主要从事外科急重症的研究。

刘宝华(1977-)，男，博士，主治医师，主要从事急重症医学的研究。

R651.1

A

1005-9202(2017)17-4212-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.020

1 长春市中医院