过氧化物酶体增殖物激活受体在酒精性肝病中的作用

1 过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)结构和生物学效应

PPAR是由配体激活的核转录因子超家族成员，在物质代谢、氧化应激、炎症反应、免疫功能变化及纤维化生成等多种生理与病理过程中扮演重要角色。PPAR存在3种亚型，分别为PPARα、PPARβ/δ、PPARγ〔3〕。PPARα位于人的第22号染色体上、PPARβ/δ位于人的第26号染色体上、PPARγ位于人的第3号染色体上。PPARα、PPARβ/δ、PPARγ在结构上有一定的相似性，均含有保守性稍差的配体结合区和高度保守的脱氧核糖核酸结合区。3种亚型中PPARα是第1个发现于啮齿类动物中与过氧化物酶体增殖物发生反应的物质，多表达于脂肪酸β氧化水平高的组织器官：肝脏、心脏、骨骼肌及棕色脂肪组织〔4〕。PPARβ/δ几乎表达于所有哺乳动物的组织中，而PPARγ则主要表达于脂肪组织，骨骼肌和肝脏仅有少量表达〔5〕。PPARs可被饱和或非饱和脂肪酸及其派生物激活，活化的PPARs进入细胞核与维甲酸X受体(RXR) 形成异二聚体，PPAR/RXR 异二聚体发生构象变化，成为由多个亚单位共同作用的激活物，激活物与位于靶基因启动区域的过氧化物酶体增殖因子反应元件(PPRE)相结合，发挥转录调节的作用〔6〕。过氧化物酶体增殖因子反应元件主要由靶基因启动子上重复序列5＇-AGGTCANAGGTCA-3＇组成。此外，PPARs还具有独立干扰某些转录因子DNA结合域的功能，以影响它们的转录活性〔7〕。

2 PPAR与脂肪代谢

应用逐渐增加酒精浓度和剂量灌胃的方法成功建立大鼠ALD模型,AFL的发生机制主要是肝细胞内脂质代谢紊乱导致脂肪堆积〔8〕，酒精明显抑制脂联素(Adipo)、沉默信息调节因子(SIRT)1和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的表达〔9,10〕，进一步增强腺苷酸活化蛋白激酶下游的固醇调节原件结合蛋白(SREBP)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶(FAS)等与脂肪酸合成密切相关的酶的活性；脂肪酸β氧化相关的肉碱棕榈酰基转移酶(CPT)1、PPAR-α及过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子(PGC)-1α等活性降低促进脂肪酸在肝细胞内沉积〔10〕。长期乙醇刺激会造成Adipo、SIRT1、AMPK及下游调脂因子表达异常导致脂类物质在肝细胞内沉积导致AFL，大量实验结果表明三者之间互相调节，Adipo以始动因素、SIRT1以枢纽作用和AMPK的效应作用形成Adipo-SIRT1-AMPK信号通路在AFL中发挥着重要作用〔11～14〕。酒精孵育H4ⅡEC3肝癌细胞株24 h减少SIRT1核蛋白50%，应用免疫共沉淀法检测到酒精喂养大鼠肝脏乙酰化固醇调节原件结合蛋白-1c增加了1.8倍〔15〕。研究还发现SIRT1能使PGC-1α的13位赖氨酸残基脱乙酰化而增强PGC-1α的功能，PGC-1α活性被SIRT1的脱乙酰化作用正性调节，PGC-1α的乙酰化状态直接反映SIRT1的活性，酒精喂养的大鼠肝组织中乙酰化PGC-1α水平明显增高，并且乙酰化PGC-1α与总PGC-1α比例明显增高，提示ALD大鼠肝脏SIRT1活性明显受抑制〔16〕。PGC-1α还可直接调节促进脂肪酸向线粒体内转移刺激脂肪酸β氧化的CPT1活性，PGC-1α活性降低后CPT1 的功能受抑制进而影响脂肪酸向线粒体内的转运。由于PGC-1α是通用的辅激活因子，可辅助激活包括PPARα等一系列核受体,PPARα主要表达于脂肪酸氧化速度较快的肝细胞、心肌细胞、肾近曲小管、骨骼肌和棕色脂肪组织,以单一形式存在。目前认为长链脂肪酸是其内源性配体，受PPARα调控脂肪酸氧化酶类基因编码的蛋白质包括：中长酰基辅酶A脱氢酶、乙酰基辅酶A氧化酶、超长链乙酰辅酶A合成酶及肝脏脂肪酸结合蛋白等，这些蛋白质主要调节肝组织线粒体和过氧化物酶体的脂肪酸β氧化代谢〔16,17〕。以上表明，酒精通过抑制SIRT1的活性削弱了对SREBP的抑制作用促进脂类合成，同时由于脱乙酰化PGC-1α减少而使其活性受抑制使得脂肪酸β氧化减少，促进脂肪酸和甘油三酯的合成，导致肝细胞脂肪变性。PPARα作为PPARs的亚型之一，高表达于肝组织，与肝脏酒精代谢和脂肪代谢密切相关。PPPARα与RXR形成异源二聚体是其发挥调控功能的初始步骤，已有大量研究〔3，7，14〕表明乙醇代谢产物乙醛抑制PPARα/RXR与靶基因DNA结合进而妨碍其正常调控功能，酒精性肝损伤的过程中，PPARα表达受抑制或缺失对肝细胞的脂肪变性及炎症的发生及发展起到了促进的作用。Crabb等〔17〕以酒精饲养C57BL/6J小鼠制备酒精性肝损伤模型，发现肝细胞蓄积大量脂质并与PPARα、RXR水平下降，PPARα/RXR功能受抑有关，主要表现为其所调控的脂肪代谢酶(长链酯酰辅酶A脱氢酶、中链酯酰辅酶A脱氢酶、CPT1水平下降；而脂肪合成酶(ACC、FAS)水平均有不同程度上调。然而给予PPARα激动剂WY14643后PPARα/RXR与靶基因结合的能力提高了3～4倍，而且上述脂肪代谢酶的水平也有不同程度逆转。Kong等〔18〕制备的ALD模型中 PPARα下游调控因子PGC-1α、CYP4A10、CYP4A14表达减少，也可被WY14643逆转；同时对肝细胞内脂肪蓄积有促进作用的FAS在该模型中其mRNA水平较对照组上调，同样也被WY14643逆转。上述实验均证明PPARα在肝内维持脂肪代谢平衡的反馈环中发挥至关重要的协调作用。此外，PPARα还有减少SREBP-2的表达和活性的作用，而胰岛素受体水平也会因PPARα活性的增强而升高，因而PPARα在减少脂质中类脂胆固醇的合成过程中同样具有调节作用〔19〕。此外，König等〔20〕也阐明PPARα和PPARγ可分别由贝特类和噻唑烷二酮类激动剂活化，进而减少甘油三酯在肝脏的蓄积及血浆水平。酒精代谢导致的肝细胞内脂质蓄积而引起的一系列应激、毒副反应对肝胰岛素的抵抗有促进作用〔21〕。此外，饮酒会导致过多的热量摄入、胰岛β细胞受损致胰岛素分泌减少甚至胰腺炎。再者，饮酒增加巨噬细胞在脂肪组织中的浸润，并改变脂肪细胞因子的表达。两种因素均可引起脂肪组织发生胰岛素抵抗，减少脂蛋白脂肪酶的抑制性，而这有助于未酯化游离脂肪酸(NEFA)的生成，循环系统中过剩的NEFA进入肝脏加重脂肪病变，最终也加重肝胰岛素抵抗。Lebrun等〔21〕酒精喂养小鼠制备ALD模型，应用检测胰岛素敏感性金标准的高胰岛素-正常血糖钳技术联合Western等实验方法作者发现模型组存在胰岛素抵抗，即胰岛素刺激组织利用葡萄糖的敏感性减弱、抑制肝糖原生成的作用减弱，肝细胞内胰岛素信号传导受抑。PPAR在ALD中的功能受抑也加重胰岛素抵抗。作者再给予PPARα激动剂后上述胰岛素抵抗现象有所逆转，因而认为PPARα在ALD中有缓解胰岛素抵抗的作用，以改善代谢紊乱。在众多影响ALD进展的因素中，遗传特性和个体差异是个不容忽视的问题，因为并非所有饮酒者均会发展为ALD。而且在ALD临床诊断标准中也特别提示需注意遗传易感因素的影响。Blednov等〔22〕以有大量嗜酒遗传特性的小鼠为实验对象研究3种类型PPARs各自激动剂对该特性小鼠长期酒精摄入量和嗜酒程度的影响。随之核查人类全基因组关联数据中有酒精依赖特性群体PPARs的基因多态性。动物实验过程中给予PPARα、PPARγ激动剂后可减少酒精摄入和对酒精的依赖性。然而给予PPARδ激动剂并不能减少酒精摄入量，有趣的是同时给予3种激动剂同样不能减少酒精摄入量。此外，PPARα激动剂非诺贝特口服2 h后其代谢产物非诺贝特酸在脑组织检测到，且其水平足以激活PPARα。综合酗酒遗传学合作研究专案的人类全基因组关联分析〔22〕表明PPAR单核苷酸多态性中PPARG、PPARΑ与酒精复发有关，PPARGC1A与酒精依赖有关联。该实验结果表明给予PPAR激动剂可有效降低有遗传特性酒精性依赖者酒精的摄入量和依赖性及酒精依赖性的复发，缓解酒精性肝损害，同时具有改善因饮酒造成神经退行性变的作用。以此进一步明确PPAR基因多态性对饮酒者是否进展为ALD有重要意义。

另一最新研究〔23〕表明氯美噻唑(CMZ)不仅是CYP2E1的抑制剂也是PPARα的活化剂。体外实验证实糖原合酶激酶(GSK)-3β可改变PPARα的A/B结构域上第73位丝氨酸磷酸化状态而调节其构象变化，GSK-3β的过表达可使PPARα稳定性变差。GSK-3β磷酸化水平是其非活性状态，CMZ通过活化磷脂酰肌醇-3羟基激酶/苏氨酸激酶(PI3K/Akt)以磷酸化GSK-3β并使其失活，因而CMZ具有增加PPARα稳定性及活性的作用。乙醇增加GSK-3β总水平的同时抑制其磷酸化水平，其活性增强，PPARα活性受抑，但CMZ组GSK-3β磷酸化水平升高，活性受抑，PPARα活性增强。因而在ALD中PPARα通过自身构象变化以调节脂质代谢，缓解酒精性肝损害〔23〕。在肝细胞，酒精经过乙醇脱氢酶(ADH)、微粒体乙醇氧化系统和过氧化酶氧化为乙醛，再经乙醛脱氢酶(ALDH)，氧化为乙酸，此代谢该过程使氧化型辅酶(NAD+)Ⅰ转变成还原型辅酶(NADH)Ⅰ，氧化型辅酶Ⅰ/还原型辅酶I比例降低，致使肝细胞氧化还原环境改变，过剩的NADH抑制脂肪酸的氧化〔24〕。PPARα所调控的基因并不影响ADH、ALDH的活性，但酒精代谢对PPARα有很强的抑制作用，随着酒精代谢产物乙醛生成量的增多,PPARα的减少，肝细胞所受伤害和毒性作用相继出现：线粒体损伤、氧化应激甚至炎性损伤〔25〕。

3 PPARα对线粒体功能具有保护作用

线粒体被公认为细胞的“动力工厂”，细胞生命活动的80%能量是由线粒体提供的。线粒体是由两层膜包被的囊状结构，由外至内具有4个功能区，即：线粒体外膜、线粒体膜间隙、线粒体内膜和线粒体基质。外膜与内膜间的空腔称为外室，由内膜包裹的腔称为内室或线粒体基质，基质中含有催化脂肪酸氧化、三羧酸循环等相关的酶类，特别是其脂肪酸β氧化能力是平衡肝细胞高流量脂质代谢的重要保障。研究〔21〕表明，线粒体结构改变和功能的变化是肝细胞功能受损的主要原因。酒精刺激能够抑制线粒体DNA复制，减少肝细胞中线粒体的数目；还可通过脂质过氧化作用损伤线粒体膜，导致Ca2+超载，使线粒体通透性转换孔由周期性开放转变为持续性开放，从而Ca2+外流，继而跨膜电位下降甚至崩溃，线粒体肿胀，形成巨大线粒体或U型线粒体，导致线粒体的结构破坏、功能受到损害，脂肪酸清除功能较正常降低，产生更多的氧自由基，影响肝细胞功能，加重肝损伤。PPARα 活化后不仅减少脂肪酸的蓄积还有助于过氧化氢酶、铜离子、锌离子、超氧化物歧化酶等抗氧化分子的生成。氧化应激有损PPARα的活性，线粒体失去抗氧化作用的保护，对氧化应激的损伤更是敏感〔25〕。Kong等〔18〕给予C57BL/6J小鼠含4%乙醇Lieber-DeCarli饮食配方喂养12 w制备酒精性脂肪肝模型，光镜下观察肝细胞内有脂变和(或)炎性改变，电镜下肝细胞超微结构显示内质网肿胀，线粒体损伤，形态各不相同，可以看到膜断裂，嵴断裂或消失，呈现巨大线粒体和U型线粒体。然而这些超微结构改变再给予PPAR激动剂后得到明显改善，因而作者认为PPARα可改善线粒体因酒精代谢造成的损伤，阻止ALD进展。

4 PPARα与氧化应激、炎症反应

氧化应激是脂肪肝进展为脂肪性肝炎的重要机制之一。长期饮酒产生过多的活性氧族(ROS)是发生氧化应激的基础，含有超氧阴离子的ROS可使脂质发生过氧化反应。Di Luzio等〔26，27〕最早发现脂质过氧化产物“亲电子体”，如丙二醛、四羟壬烯醛，可对细胞内一些重要蛋白结构进行修饰从而使其失去正常功能，对细胞代谢稳态产生负面影响。脂质过氧化产物对肝细胞的毒性损伤可进一步激活Kupffer细胞、促炎因子骨桥蛋白、肿瘤坏死因子(TNF)-α、转化生长因子(TGF)、PI3K、基质金属蛋白酶等，终究引起一系列炎症级联反应。此外，肠腔内蓄积的乙醛在增加肠腔渗透压的同时使内毒素(LPS)更容易随循环系统进入肝脏代谢。LPS不仅对肝细胞有直接毒性作用，同时也将致敏Kupffer细胞使其释放TNF-α等促炎因子，引起肝损害。PPARα已被认可具有重要的抗炎作用〔27〕。PPARα活化后通过减少氧化应激、抑制炎症反应以缓解酒精对肝脏的打击。Kong等〔18〕应用C57BL/6J小鼠制备酒精性肝损伤模型，发现模型组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平较对照组明显升高，表明酒精引起肝损伤。模型组再给予PPARα激动剂WY14643后，血清ALT、AST水平均有所下降。同时促炎因子PI3K及环氧化酶-2在此模型中表达均有所增加，然而给予WY14643后PI3K mRNA 及蛋白水平较给予前表达减少，此外，炎性因子TNF-α、TGF-β1、骨桥蛋白mRNA 及蛋白水平较前也减少。而抗炎因子脂联素、IL-10因PPARα的活化表达增多。该实验表明PPARα通过下调促炎因子骨桥蛋白、TNF-α、TGF-β1、PI3K、环氧化酶-2、上调脂联素、IL-10等保护性因子在ALD中发挥重要抗炎作用。

核转录因子(NF)-κB可以与某些基因上启动子区的固定核苷酸序列结合，从而启动基因转录。NF-κB同样也是一类核转录激活因子。当未受到外界刺激时，IκB通过其C末端特定的锚蛋白重复序列与NF-κB结合，形成p50-p65-IκB三聚体，使NF-κB其以无活性的形式存在于细胞胞质中；当细胞受到外界信号刺激后，IκB磷酸化，激活IκB激酶复合体(IKK)，使NF-κB暴露核定位位点，游离的NF-κB二聚体p50/p65迅速移位到细胞核，与特异性IκB靶基因位点结合，从而启动相关基因转录程序。给予PPAR活化剂有助于IKBα mRNA和其蛋白水平的表达，即PPAR具有诱导IKBα表达的作用。因而PPAR对IKBα的诱导功能可能是其具有抗炎作用的部分机制〔7〕。

5 PPARα与肝纤维化

因酒精代谢引起的氧化应激及释放的炎症因子TGF-β1可活化肝星状细胞(HSCs)使其转化为肌成纤维细胞细胞，一旦活化，它将移动到肝脏受损处并分泌细胞外基质(ECM)。TGF-β1也具有抑制ECM降解，促进ECM生成的作用，在促进肝纤维化进展过程中扮演重要角色〔28〕。PPARα具有下调TGF-β1的作用，因而PPARα的抗炎作用可间接减少ECM生成，继而阻止纤维化的进展。平滑肌细胞肌动蛋白(SMA)是肝星状细胞活化的标志。Nan等〔29〕在制备的ALD模型中利用α-SMA的表达来评估PPARα在肝纤维化进展中的作用，发现与对照组相比，模型组α-SMA的表达明显增多，然而给予PPARα激动剂后，SMA的表达显著受抑制，推论PPARα在阻止ALD进展机制中具有抗纤维化作用。

综上，酒精代谢破坏PPARα功能、脂质代谢平衡致使肝内脂质聚集过多超过肝负荷，引起的肝细胞脂肪变性可归结为第一次打击。然而肝组织内过量脂质浸润使其对其他伤害更为敏感，可引起线粒体损伤、氧化应激及炎症反应，给肝脏造成第二次打击。PPARα在ALD由AFL逐步进展为AH、AHF过程中均具有重要阻遏作用，甚至酒精对神经系统的损伤也有保护作用，但其保护机制仍需进一步探讨，使其有望成为控制ALD进展的有效药剂。

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〔2016-07-12修回〕

(编辑杜娟)

R575.5

1005-9202(2017)21-5481-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.116

1 河北医科大学第三医院感染疾病科

2 河北北方学院附属第二医院感染管理科

周俊英(1965-)，女，主任医师，教授，博士，博士生导师，主要从事各种感染性疾病尤其是各种急慢性肝病治疗研究。

曹智丽(1980-)，女，主治医师，硕士，主要从事肝脏疾病的诊断及治疗研究。