食源性单增李斯特菌检测技术研究进展

孙玉霜，李 颖，李秀梅，杨 颖

（天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402）

食源性单增李斯特菌检测技术研究进展

孙玉霜，李 颖，李秀梅，杨 颖

（天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402）

单增李斯特菌是一种常见的食源性致病菌，会导致严重的人兽共患病。目前单增李斯特菌的检测方法主要包括传统方法、酶联免疫法、免疫胶体金技术、PCR检测技术、等温扩增技术、全自动微生物检测系统、生物芯片技术等。本文对各方法的原理、优缺点、应用情况及发展前景进行了概述。

单增李斯特菌；检测；进展

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是李斯特菌属中致病力最强的革兰氏阳性菌，是一种常见的食源性致病菌。由于其在细胞内寄生，可穿越宿主的三道屏障，会导致严重的人兽共患病。有研究表明，LM在即食性食品中的污染率达31%。近年来，由此引发的食品中毒病例不断增加。20世纪90年代世界卫生组织（WHO）将其列为四大食源性致病菌之一。近年来，我国建立了全国食品污染物监测网和食源性疾病监测网，重点监测LM。国家食品安全法规定食物中不得检出LM。由于LM的严重危害性，各国学者们也针对食品中LM的检测技术进行了大量研究，以寻求快速、简单、高灵敏度的检测方法。

1 传统生物学分离培养与生化鉴定法

传统的检验方法是将通过分离培养后产生的可疑菌落进行生化反应、溶血实验、协同溶血实验、动物实验、典型运动后，再进行血清分开，耗时长，且工作量大。目前我国常用的是国标法和显色培养基诊断法。

1.1国标法（EB法）

国标法是我国国标《食品卫生微生物学检验：单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB4789.30—2008）采用的方法。该方法一般需要5～14 d，在食品中检出英诺克李斯特菌的几率比LM高。但该方法容易造成假阳性和假阴性的出现，且存在杂菌与LM肉眼难区分的缺点，需要进一步验证。

1.2显色培养基诊断法

该方法是利用酶与底物的相互作用产生显色物质或荧光物质，将能与LM的毒力因子PI-PLC酶和β-D-葡萄糖苷酶反应的一类底物加入分离培养基中，使LM与其他菌落形成色差。该方法比EB法节省了时间、人力和原材料投入。

2 免疫学检测技术

免疫学方法主要是利用抗原抗体反应的特异性来进行定性或定量分析，与传统方法相比，具有操作简便、灵敏、快速、可同时检测大量样品等优点。目前，该方法已成功用于食品中LM的检验。

2.1酶联免疫法（ELISA）

1987年，Faber等首次报道了针对LM鞭毛抗原的单克隆抗体酶联免疫检测技术。我国学者利用该方法进行了检测，结果表明2～3 d内从自然污染样品中可检出该细菌。1992年，Bhuria等利用淋巴细胞杂交瘤技术，制备了一株能稳定分泌抗单核细胞增生性李斯特菌的单克隆抗体的细胞株EM-7GI，以此抗体建立的夹心ELISA法能在20～24 h内检测出细菌8～10个/mL（g），并与其他种李斯特菌等无交叉免疫反应，具有高度特异性。Kim等采用5株特异性单抗体建立了夹心 ELISA，将待检样品富集培养后检测LM，实验表明该法在 LM和英诺克李斯特菌的检测中具有较高的灵敏度和特异性，适合大量食品样品的初筛检验。

2.2胶体金免疫层析法（GIGC）

GIGC是在抗原抗体反中以胶体金作为免疫示踪物的免疫标记方法，在食品检测中普遍应用。罗立新等[1]利用柠檬酸钠改良方法制备胶体金，检测了冷冻猪肉、牛奶、冰淇淋以及不同稀释度的LM标准样品，灵敏度为87.5%，证明了该方法的可行性。谢士嘉等[2]建立的胶体金免疫层析技术快速定量检测方法能在10 min内完成定性和半定量检测。刘美辰等[3]研制的双抗夹心法免疫层析试纸条灵敏度可达1×10-6CFU/mL，具有快速、灵敏、准确、特异性强等优点。

3 核酸探针检测技术

核酸探针检测技术是以目标菌的毒力基因为靶基因，利用碱基配对原理使互补的2条核酸单链杂交形成双链，以鉴别待测样品中目标菌。Byron等[4]针对李斯特属16S核糖体亚单元的特异序列设计了6个荧光标记的肽核酸探针，与整个细胞进行原位荧光杂交。续文彬[5]选择LM同源性较高致病基因hlyA设计了21 bp大小的发光探针与目的核酸片段杂交，利用差分水解，水解速度缓慢的DNA-RNA杂交体探针在加入碱性H2O2后被发光仪检测到，实验仅需30 min且具有高度特异性；利用该方法同时检测100份鸡肉样品，其阳性率为15%，与常规生化鉴定结果一致。张广腾等[6]在玻碳电极表面修饰金纳米颗粒，利用金-硫键固定巯基修饰的ssDNA探针，制备了电化学DNA生物传感器。该方法灵敏度高、线性范围宽、选择性良好，可用于快速检测。

4 聚合酶链式反应检测方法

美国科学家Kary Mullis在1985年发明了PCR。由于该技术具有高度特异性、敏感性、快速简便等特点，在检测食品中LM等方面展现了巨大潜力。

4.1单重PCR

单重PCR利用LM具有特异性的毒力基因序列设计引物进行扩增来检测该致病菌。Wieckouska等利用PCR扩增编码李斯特溶血素基因（hlyA）片段以检测牛奶中的单增李斯特菌，检测极限为50 CFU/L牛奶样品。Almeida等以LM的inl基因为靶基因扩增得到760 bp特异性片段进行检测。单重PCR与上述其他方法比较，灵敏度较高，但由于前期需经过增菌稀释干扰成分，因此耗时2 d才能完成检测。于丰宇等[7]针对LM的hlyA、plcB、inlA、inlB、inlC、inlJ和prfA 等基因设计引物，进行 PCR 扩增，结果表明内化素基因（inlA、inlB、inlC和inlJ）的缺失可能是导致菌株毒力降低的原因。

4.2套式PCR

设计2对PCR引物进行2次扩增，得到首次PCR引物扩增片段后，将第2对引物（又称巢式引物）结合在第1次PCR产物内部，使得第2次扩增片段短于第1次，降低了1次扩增产生错误片段的概率。马保华等[8]根据LM的iap基因设计了2对特异性引物，建立的套式PCR能有效排除干扰成分，检测限为10 CFU/mL，整个实验可在7 h内完成，适用于食品中LM的快速检测。但由于该方法需进行2次扩增，检测中在第1次扩增结束后需打开PCR管添加第2对引物，存在易污染的缺点。

4.3多重PCR

多重PCR检测可以在1个反应体系中添加多组PCR引物，同时扩增某个病原菌的或多个病原菌的基因，提高了实验的特异性，降低了实验成本，实现了高通量的检测。目前该技术已经成功应用于许多食源性致病菌的检测。李盛丰等[9]采用针对LM的毒力基因iap和prfA基因分别设计引物，利用单个PCR、套式PCR、多重PCR这3种方法检测，结果表明多重PCR灵敏度为104CFU/mL，在特异性方面比其他2种PCR更具优势，而套式PCR在灵敏度方面存在显著优势。

4.4实时荧光PCR

实时荧光PCR在PCR定性基础上发展起来的核酸定量技术，具有实时检测、准确性高、操作简便、高通量、灵敏性高、特异性高特点，且由于扩增检测体系封闭，交叉污染率低，又可分为探针类和非探针类。非探针类具有操作简便，实验成本低优点，仅需观察实验中以温度和荧光信号改变量建立的溶解曲线即可实现实时定量检测。探针类是在反应体系中增加了特异性探针，特异性更高。Barbau-Piednoir等[10]建立的荧光PCR方法可对单增李斯特菌和李斯特菌属其他菌种进行定性实验，区分李斯特菌属的不同菌种，检测精确度高达98.08%。闫冰等[11]以LM毒力基因hlyA为靶基因，设计特异性引物和TaqMan探针进行对人工污染牛乳样品进行实时PCR检测，经1 h增菌，可检出3×102CFU/mL，经3 h增菌，活菌检测限可达30 CFU/mL；经6 h增菌，检测限为17 CFU/mL，验证了该方法的高特异性。但该技术需要专门的实时荧光定量PCR，且对引物和探针要求较高，实验成本较一般PCR偏高，因此限制了RT-PCR在基层实验室的应用。

4.5免疫磁珠PCR

将磁性球用抗体或其他配体包被后产生特异性抗体获取靶细胞，再将富集磁珠上的病原进行常规检测，不需要提取核酸，可直接从待检样品增菌培养物种富集目的菌排除其他杂菌，具有检测时间短、操作简便、高灵敏度等优点，因此其应用与研究前景十分广泛。李敏等[12]将免疫磁珠与双重PCR相结合检测LM，在保证灵敏度的前提下提高了检测特异性，将假阳性的可能性降至最低，为下一步筛选节省了人力、物力和时间。但由于该技术存在成本高、检测抗原单等缺点，未能得到普及应用。

除上述PCR检测技术外，还有以PCR与ELISA技术相结合的PCR固相分析法。有研究者还将PCR-ELISA与多重实时荧光定量PCR 相结合，检测肉品和牛奶中的大肠杆菌，兼具了PCR、分子杂交、ELISA这3种方法的优点，操作简便、特异性高、设备要求低，因此PCR-ELISA也是今后检测LM的发展趋势。

5 等温扩增技术

5.1环介导等温扩增（LAMP）

LAMP是2000年由Notomi等[13]开发的新型核酸扩增技术。该技术针对靶基因的6个区域设计了4条特异性引物，利用特异置换DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增。张亚爽[14]以LM的毒力基因hly为靶基因，选择特异性引物进行PCR扩增，同时设计了LAMP反应相比较，2种方法相比灵敏度分别为1.4×102CFU/mL和7.3×101CFU/mL，直接检测鸡肉中LM，检出限分别为9.6×102CFU/g和8.9×101CFU/g，表明LAMP更快速、更灵敏。姜霞等[15]对不同培养浓度单增李斯特菌进行LAMP与PCR比较，结果显示其灵敏度比普通PCR高100倍，在人工污染肉中的检出限为8.8×10-1CFU/m L，在1 h内即可完成扩增反应。由于其快速、特异、灵敏度高等显著优势，近年来在我国食品致病菌检测研究中得到广泛应用。

5.2核酸序列等温扩增（NABSA）

NABSA是一种恒温的体外核苷酸扩增方法，又称自主序列复制。Blais等[16]针对mRNA建立了扩增hlyA基因的NASBA方法，并用于奶制品和蛋制品的48 h增菌培养上清的检测。据国外报道，该方法能检测到100个目标分子和LM对数期的40个细胞。另有研究采用NABSA，结果显示增菌前灵敏度为500 CFU/反应，增菌后可达0.2 CFU/g。以上都表明NABSA是一种灵敏度高、特异性强的检测技术，应用前景十分广泛。

6 全自动微生物检测系统

随着计算机技术的发展，微生物检测全面自动化将逐渐取代平板、试管等传统检测方式，成为未来发展方向。目前，国外已有多种微生物检测系统问世。

6.1全自动微生物生化鉴定系统

目前国内外使用较多的全自动微生物生化鉴定系统有API、ATB、VITEK和VIDAS等。其中API是手工操作系统，鉴定范围广泛，系统收录了15个系列的600种微生物生理生化指标，且数据库仍在不断更新。ATB是在API上建立起来的，省去了培养并手工接种至试纸条和肉眼判读的操作，减少了人为误差，提高了检测准确度。VITEK系统是新一代升级系统，在我国也得到广泛应用。李玉等[17]利用API与VITEK系统分别对20株沙门氏菌、40株单增李斯特菌、30株金黄色葡萄及30株蜡样芽孢杆菌进行鉴定，结果表明2个系统的符合率为100%。

6.2全自动酶联免疫分析系统（VIDS）

VIDS可以自动化检测几乎所有的国际规定的致病菌。孙素霞等[18]采用VIDS和常规细菌培养法检测148份冻肉样品，结果VIDS法检测阳性样品28份，常规细菌培养法阳性16份，且16份均为VIDS检测阳性的样品。表明VIDS法检测冻肉LM灵敏度为100%，特异度为90.9%，且检测周期大大减小。

6.3分子生物学致病检测系统

由于分子生物学检测方法的灵敏、快速、特异的显著优势，国内外各种新型分子生物学检测系统不断涌现。杜邦的BAX系统采用探针标记PCR扩增技术；美国Bio Control公司推出的全自动致病菌磁珠富集和基因检测系统结果更准确、更灵敏。杜强等[19]利用全自动微生物磁珠分选系统检测400份自然样品并与国标法对比，结果显示该系统简单易用、标准化程度高。还有在RT-PCR、rep-PCR、核糖体分型技术等基础上建立起来的全自动仪器，此类系统都具有有分子生物学检测技术的优点，但由于研发多为国外公司，存在成本高、后期维护不及时等缺点，因此国内推广应用较少。

7 生物芯片技术

该技术是从20世纪90年代中期发展起来的，通过微阵列方式集成大量生物分子，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。目前许多学者已经建立新型生物芯片技术，我国有学者采用基因芯片检测多重PCR的扩增产物，可同时检测LM等10种常见致病菌。

8 电子鼻

目前电子鼻等方法在微生物检测中也提供了有价值的分析手段。陈丽萍[20]等利用基于金属氧化物传感元件阵列的PEN3型电子鼻传感器，对不同食源性致病菌代谢物的差异证明，该方法在低浓度下对不同致病菌有区分性。

8 结论

随着人们对食品安全问题的关注，单核细胞增生李斯特菌作为重要的食源性微生物对人类健康的潜在危害越来越受到重视，因此近年来检测方法得到了很大发展。传统方法虽然检测效率较低，但作为细菌分离培养的基础，能够为微生物学研究提供必须材料，因此目前无法被取代。以免疫学为基础的方法，检测时间较传统方法大大缩短，且检测成本较低，是我国目前使用较为广泛的方法。而以分子生物学为基础的方法，显著提高了检测方法的特异性和灵敏度，提高了检测效率，检测的同时可以得到致病菌耐药性、遗传性等信息，为流行病学调查和综合防治提供了大量信息，但由于检测环境和成本要求较高，因此应用范围受到了一定限制。另外，还有一些新兴的检测技术，如等温扩增、生物芯片、检测系统平台以及多方法的联合检测技术等，仍需要不断验证评估后，才能被广泛接受应用。因此单核细胞增生性李斯特菌的检测技术仍需要广大技术人员不断探索研究，从而为我国食品安全快速检测提供技术保障。

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（责任编辑：杜宪）

Reseach Progress of Detection Technology for Listeria monocytogenes

Sun Yushuang，Li Ying，Li Xiumei，Yang Ying
（Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center，Tianjin 300402）

Listeria monocytogenes is a common foodborne pathogenic，which can cause zoonosis. There are several main detection technology methods of Listeria monocytogenes，including ELISA，GIGC，PCR，isothermal amplif i cation，detection of microbiology automatic，microarray and so on. The theory，advantages and disadvantages，applications and prospect aboat the different methods were reviewed in this paper.

Listeria monocytogenes；diagnosis；progress.

S855.1

B

1005-944X（2017）08-0076-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.021

国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（2012AA101605）；天津市科技支撑计划重点资助项目-食品生物危害物精准检测与控制技术研究（10ZCZDNC02800）