蜜蜂体表携带花粉种类、数量和活力评估的研究方法

陈新兰 董 坤

（1 云南省蜜蜂资源可持续利用工程研究中心 云南农业大学东方蜜蜂研究所 云南农业大学食品科技学院，昆明 650201；2 云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201）

在自然界中，大约85%的显花植物依赖昆虫授粉，其中蜜蜂是最理想的授粉昆虫。据1899年Knutr记载，在植物上采集到的800多种传粉昆虫中，膜翅目就占了43.7%，且蜜蜂总科占其总数55.7%[1]。此外，我国吴燕如教授曾调查了猕猴桃花期中传粉昆虫的种类，共鉴定的16种传粉昆虫中，蜜蜂占68.75%[2]。由此可见，蜜蜂在植物授粉中占据着重要的地位。

蜜蜂授粉不仅可以增加农作物的产量、改善果实和种子的品种以及提高后代的生活力，还有利于生态环境的改善[3]。本课题组在开展中蜂为腾冲红花油茶授粉效果研究中发现，中蜂自由式授粉可以显著提高腾冲红花油茶的坐果率及结籽率[4]；此外，在研究蜜蜂为石榴授粉中发现，蜜蜂授粉可以提高石榴的坐果率及果实品质[5]。国内外专家的大量研究均表明蜜蜂授粉对农作物和果树等的增产是不可估量的。

蜜蜂的授粉性能可以从三个方面考虑：测定蜜蜂访花后的坐果率或结籽率；测定蜜蜂体表携带的花粉种类、数量以及柱头上有效的花粉落置数量；测定蜜蜂授粉后植物的繁殖成功率，即生殖效率[6]。蜜蜂体表携带花粉的种类数量及柱头上有效的花粉落置量，在一定程度上影响着授粉成功与否。由于繁殖成功不仅依赖于传粉昆虫传播的花粉数量，也依赖于其他因素，比如：花粉和雌蕊的相互作用、雌花的选择，所以在评估蜜蜂的授粉性能时，主要对前两个方面进行观察[7]。本文主要介绍了国内外针对蜜蜂体表携带花粉种类鉴定、花粉粒计数及花粉活力测定等方面的研究方法，并比较了各种方法的优缺点，以期为其他同仁开展此类研究提供一些有益的帮助。

1 花粉种类鉴定方法

鉴定蜜蜂体表携带的花粉种类，首先需从蜜蜂体表淋洗花粉粒。可通过冲洗或涡旋蜜蜂身体使其身上的花粉粒淋洗下，然后通过离心方法使花粉粒沉淀，得到的花粉粒用于进一步的分析。为了研究授粉效率，蜜蜂后足花粉筐里的花粉团在淋洗蜜蜂前应该去掉，因为花粉团通常对授粉没有太大作用。如果对蜜蜂的采集行为观察非常细致，也可只从蜜蜂身体接触了柱头的部位上取下花粉进行分析鉴定[8]。

蜜蜂身上携带的来自不同植物的花粉，通常可以依靠诊断其性状来区分，比如：花粉粒的大小、花粉外壁纹饰、花粉孔和花粉沟的数量及大小等[9]。光学显微镜是最早用于观察研究花粉的工具，至今已有300多年的历史，且一直沿用至今。到了20世纪60年代，扫描电子显微镜开始用于观察花粉，其所得图片不仅立体感强、清晰逼真，且能揭示很多光学显微镜所无法揭示的信息，近几十年已在花粉形态研究中广为应用[10]。目前有研究人员也开始尝试通过分子生物学方法鉴定花粉种类。

1.1 光学显微镜的鉴定方法

这是鉴定花粉运用最广的一种方法。在花粉鉴定前，花粉要经过醋酸水解及染色，醋酸水解溶液包括冰醋酸和浓硫酸（9:1），其水解及染色过程为[7]：

（1）加入花粉样本于冰醋酸溶液中10 min，然后进行离心，弃去上清液；

（2）加入少量摩尔的醋酸水解混合液（冰醋酸:浓硫酸=9:1）；

（3）在水浴中将溶液缓缓加热到沸点，并用玻璃棒不停的搅拌；

（4）将溶液冷却几分钟，进行离心，然后弃去上清液；

（5）重新悬浮在蒸馏水中，进行离心，然后轻轻倒出上清液，重复这个步骤；

（6）用甲基绿或醋酸洋红进行染色，以便更好观察。

醋酸水解及染色之后，花粉可以保存，并制成永久装片，常用方法是用甘油胶封片。其过程如下[7]：

（1）准备少量的甘油明胶，通常由10 g 明胶、30 ml 甘油和35 ml 蒸馏水混合而成；

（2）在干净的显微镜载玻片上加一滴准备好的甘油明胶、花粉样本和染色剂；

（3）缓缓地对装片加热，搅动使其彻底地均匀混合；

（4）盖上盖玻片，在边缘四周用指甲油或其他清漆封住即可。

利用光学显微镜观测上述染色后的花粉或花粉永久玻片，通过花粉的外部形态和大小即可鉴定花粉的种类。该方法的优点是操作简便，科研人员可自己操作观测，成本低，省时省力，对形态结构差异大的花粉易鉴定，但是对于差异小的花粉，很难对其进行鉴定[11]。

1.2 扫描电子显微镜的鉴定方法

扫描电子显微镜也是鉴定花粉很普遍的方法，其一般过程是取花粉样本，用导电胶将其固定样品台上，喷金，选用适当电压，然后进行观察[12]。用此方法可观测到花粉外壁表面的纹饰、花粉孔及花粉沟的数量和大小，易鉴定差异小的花粉，但其成本高。由于扫描电子显微镜价格昂贵，通常有专门固定人员操作使用，科研人员一般只需送样、等待电镜图片结果。

1.3 分子生物学的鉴定方法

鉴定花粉种类还可以用分子生物学的方法。如果蜜蜂只携带同一个种的植物花粉粒，那这很简单，因为大量的花粉可以合并，从而可以一起提取DNA。但是如果蜜蜂携带着不同种植物的混合花粉，分析混合花粉就变得很难。在这种情况下，可以用单一花粉基因型策略，即对单一花粉粒的基因组进行PCR扩增[13]。相对于光学显微镜和扫描电子显微镜，此方法能更精准的确定花粉种类，但操作复杂，耗时耗力。

2 花粉数量观测计数方法

2.1 血球计数板的观测方法

这是花粉粒计数最常用的方法。血球计数板最初主要用于血细胞计数，但它也可以用于计算一个标准体积的花粉粒溶液中的花粉粒数量[7]。首先，将从蜜蜂身上收集的花粉制成花粉悬液，然后在血球计数板上滴一滴一定体积的花粉悬液，再放于显微镜下观察，数出这滴悬液中花粉粒的数量，就能计算整个悬液中花粉粒的总量[14]。具体操作步骤如下：

（1） 从蜜蜂身上收集花粉；

（2） 使花粉粒悬浮在已知体积的70%乙醇溶液中，进行涡旋以确保混合均匀；

（3）用移液管取一定量的花粉粒悬液于血球计上；

（4）在显微镜下观察并计数。血球计厂商规定了在观察视野下的已知体积悬液，并提供简单的用法说明（在初始悬液中，可以从目标计数推回到绝对计数）；

（5）当花粉粒的数量很少时，要测量的悬液可以滴在带有刻度的显微镜载玻片上，然后数出所有的花粉粒。

2.2 其他方法

除了运用血球计数板对花粉进行计数外，还可使用成本更高的方法，如：电子粒子计数或基于激光的计数器。此外，也可使用立体显微镜直接对蜜蜂身上的花粉粒进行计数，但误差相对更大。

3 花粉活力的测定方法

3.1 荧光反应法（FCR）

这种方法主要用于测定花粉萌发前的花粉活力，此方法是基于二乙酸荧光素（FDA）的荧光反应。FDA是一种可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内的物质，因此有活力的花粉一般都能在显微镜下发出荧光[15]。

3.2 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）

根据有活力的花粉粒在呼吸过程中产生氧化还原反应，无活力的花粉粒无此反应的原理,当氯化三苯基四氮唑（TTC）渗入有活力的花粉粒内，并作为氢受体被脱辅酶上的氢还原时，便由无色的TTC变为红色的三苯基甲唑（TTF），这种方法适用于经干燥等加工处理后的新鲜花粉，对陈旧不新鲜的花粉不适用。具体方法步骤是：从蜜蜂身上取少量花粉放于载玻片上，加0.5%的TTC溶液1～2滴，然后盖上盖玻片，放于35℃左右的恒温箱中15 min，最后用显微镜进行观察，有活力的花粉染成深红色，败育花粉染成绿色[16]。

3.3 过氧化物酶测定法

有活力的花粉含有活跃的过氧化物酶，此酶能利用过氧化氢使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉的活性强弱。具体方法步骤是：首先将0.5%联苯胺、0.5% α-萘酚和0.25%碳酸钠混合均匀，然后滴1滴于载玻片上，再滴1滴0.3%过氧化氢，然后放入少量花粉，搅匀，盖上盖玻片，于30℃环境下放置30 min左右，最后在显微镜下观察，有活力的花粉呈现红色[17]。

3.4 碘-碘化钾法（I-KI）

此法常用于鉴定含淀粉质类花粉，染成蓝紫色的为发育好、活力强的花粉，呈黄褐色的为发育不良的花粉。具体方法步骤是：取少量花粉放于载玻片上，先加1滴蒸馏水，再加2滴碘-碘化钾溶液（将2 g碘化钾溶于10 ml蒸馏水中，再加入1 g碘，用玻璃棒搅拌至全部溶解，最后加蒸馏水定容到300 ml），盖上盖玻片，在显微镜下观察，被染成蓝色的即为有活力的花粉[17]。

3.5 蔗糖溶液培养基培养法

蔗糖培养基由10%蔗糖、100 mg/kg硼酸和5 mg/kg赤霉素配制而成，其中，蔗糖的作用是维持花粉与培养基之间的渗透平衡，以及提供花粉萌发所需的营养物质和能量来源，不同植物花粉的萌发所需要的蔗糖浓度不同；硼酸的作用是促进糖的吸收和代谢，同时增加氧的吸收，这有利于花粉的萌发，不同植物花粉萌发所需要的硼浓度也有所不同。具体方法步骤是：将新鲜花粉直接放于蔗糖培养基中培养，12 h后，在显微镜下观察，如果花粉管有明显的伸长（花粉管的长度至少是花粉粒直径的2倍），则为有活力的花粉[18]。

荧光反应通常是测定花粉营养细胞质膜的完整性和细胞质非特异性酯酶的活性，操作简单，反应明显，容易观察，但是二乙酸荧光素具有一定的毒性；TTC法、过氧化物酶法和I-KI法都是染色法，在染色过程中存在比较大的误差性，但是省时省力，成本低；蔗糖溶液培养基法实用，简单，可直接观察花粉管的发育情况，准确性高，但耗时。

不同植物花粉的特性不同，所需要的适宜染色条件也不同[19]。TTC染色法常用于测定花粉活力的强弱，它的染色效果和花粉中的脱氢酶有一定的关系，王艳哲等[20]在研究测定玉米花粉活力发现，TTC能准确、快速的测定玉米花粉活力，但是有报道TTC法测定黎豆、辣椒等花粉活力时，效果不明显或不能染色。I-KI染色法适宜测定淀粉质类花粉，即对禾本科类植物的花粉进行染色时，效果明显。俞奔驰等[21]发现用I-KI法能准确的测定木薯花粉的活力，但是TTC法和培养基法效果不理想。蔗糖溶液培养基培养法适用广，效果明显，对大多数植物的花粉活力测定有显著的效果。但需要注意的是，不同植物的花粉萌发所需的蔗糖、硼酸和赤霉素比例不同。综上所述，不同的测定方法，对植物花粉的测定效果各不同，因此，应结合花粉特性、染色效果、染色时间及试剂比例等条件来选择一种合适的花粉测定方法。

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