白藜芦醇pH敏感共聚物胶束的制备与评价

赵海霞，常 琦，董丽艳，乔明曦

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

白藜芦醇pH敏感共聚物胶束的制备与评价

赵海霞，常 琦，董丽艳，乔明曦*

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

目的以聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-聚组氨酸（mPEG-PLA-PHis）pH敏感嵌段共聚物为载体材料，制备白藜芦醇载药胶束，并对其处方和工艺进行优化和体外评价。方法采用薄膜分散水化法制备白藜芦醇胶束，应用中心复合设计-效应面法优化白藜芦醇胶束的处方和制备工艺；透析法考察载药胶束在不同 pH值磷酸盐缓冲液中的释药行为。结果在优化条件下制备的胶束平均粒径为54.13 nm，包封率(90.69±1.87)%，载药量为(10.25±0.64)%，载药胶束的体外释药行为具有pH敏感性。结论中心复合设计-效应面优化法的预测性较好，所制备的pH 敏感性白藜芦醇胶束粒径小且均匀，载药量和包封率均较高。

药剂学；共聚物胶束；星点设计；白藜芦醇； pH敏感

肿瘤组织的细胞在增殖能力和表型上存在异质性。肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是在肿瘤组织中存在的少数具有增殖能力和分化潜能的一类细胞[1]。肿瘤干细胞学说[2]认为，肿瘤是由为数较少的肿瘤干细胞及由其产生的分化程度不一、数量较多的非干细胞样细胞群组成。传统的化疗药物只能杀死一部分没有增殖能力的非干细胞样肿瘤细胞，但对肿瘤干细胞疗效甚微，其原因在于肿瘤干细胞或对化疗药物具有很强的耐药性，且肿瘤干细胞多处于静息期，化疗药物对其并不能发挥杀伤作用[2-3]。白藜芦醇[4]（resveratrol）是一种于1940 年首次从毛叶藜芦根部提取分离出并存在于多种植物中的一种二苯乙烯类化合物。白藜芦醇可以有效抑制人胰腺癌、乳腺癌、鼻咽癌等多种肿瘤干细胞团块的生长、降低其存活率和自我更新能力[5-6]。随着对白藜芦醇抗肿瘤干细胞的研究日渐丰富，白藜芦醇展现出广阔的抗肿瘤应用前景。由于白藜芦醇水溶性极差（＜3 mg·L-1），有必要对白藜芦醇进行制剂学研究增加其水溶性。

两亲性嵌段共聚物可在水性介质中自组装形成稳定的壳-核结构的纳米递送系统，其疏水性内核可作为水难溶性药物的贮库，亲水性外壳赋予胶束良好的水溶性和空间稳定性[7-8]。聚合物胶束可以利用肿瘤组织的增强透过性及滞留（enhanced permeation and retention，EPR）效应选择性地蓄积在肿瘤部位，减少化疗药物在正常器官和组织的分布，从而达到减毒增效的目的。pH敏感嵌段共聚物胶束还可以利用肿瘤微环境与正常组织的pH值差异，实现pH值触发释药，加速抗肿瘤药物在肿瘤部位的释放，提高肿瘤部位游离药物浓度[9]。采用组氨酸低聚物修饰的聚合物具有明显的pH值敏感性，组氨酸基团在酸性环境中可结合质子，导致组氨酸低聚物产生疏水至亲水的转变[10]，同时组氨酸低聚物在内涵体和溶酶体弱酸性环境下可结合质子，可通过“质子海绵”作用和渗透压作用[11]介导药物产生内涵体逃逸行为，提高载体递送药物的有效性。

本文作者采用mPEG-PLA-PHis共聚物作为白藜芦醇载体，制备白藜芦醇pH敏感胶束，应用中心复合设计-效应面法优化白藜芦醇载药胶束的处方和制备方法，同时对载药胶束的制剂学性质进行研究。

1 仪器与材料

RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义予华仪器有限责任公司）， Nano ZS90粒度分析仪（英国Malvern仪器公司），KYC 100B恒温振荡器（上海福马实验设备有限公司），JEM 2100透射电子显微镜（日本电子株式会社），ALC110.4分析天平（德国Sartorius公司），低温恒温反应器（河南巩义英峪予华仪器有限公司），高效液相色谱仪（日本Hitachi公司），湘仪TG16-W微量台式高速离心机（湖南长沙湘仪检测设备有限公司）。

mPEG-PLA-PHis嵌段共聚物（实验室自制，批号20141115，GPC测定Mp为5 493，Mn为4 058，Mw为4 322，多分散系数为1.064），白藜芦醇（纯度质量分数≥98%，陕西冠捷生物科技有限公司），乙腈、甲醇（色谱纯，天津科盟化工工贸有限公司），吐温80（天津博迪化工公司），透析袋（上海绿鸟公司，MWCO =1.4×104）

2 方法与结果

2.1 白藜芦醇胶束的制备

采用薄膜分散水化法制备白藜芦醇的mPEG-PLA-PHis胶束。精密称取mPEG-PLA-PHis 10 mg和白藜芦醇1.25 mg，置于茄形瓶中，加入乙腈8 mL溶解共聚物和药物。于45 ℃ 水浴下减压旋转蒸发40 min除去乙腈，将茄形瓶置于干燥器中抽真空干燥过夜。在55 ℃ 下加入相同温度的pH值7.4 PBS 10 mL（10 mmol·L-1）水化15 min，1.2×104r·min-1下离心10 min，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得mPEG-PLA-PHis载药胶束溶液。

2.2 白藜芦醇的含量测定

色谱条件：色谱柱为Diamonsil ODS C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（体积比为40∶60），流速为1.0 mL·min-1，检测波长306 nm，柱温35 ℃，进样量20 μL。空白胶束溶液和白藜芦醇胶束的色谱图见图1，结果共聚物载体材料不干扰白藜芦醇的测定。

取白藜芦醇对照品适量，精密称定，配制质量浓度分别为4.0、8.0、12.0、16.0和20.0 mg·L-1白藜芦醇对照溶液，进样测定。标准曲线方程为A=1.674 0× 105ρ+1.236 0×104，r=0.999 9，白藜芦醇质量浓度在4.0～20.0 mg·L-1线性关系良好。该色谱方法的精密度、回收率均符合要求。

2.3 载药胶束的包封率与载药量测定

取载药胶束溶液于1.2×104r·min-1下离心10 min，弃掉游离的药物。取上清胶束溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤。精密移取该胶束溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度。取20 μL进样，测定胶束溶液中药物浓度。按下列公式计算白藜芦醇胶束的包封率（wEE）和载药量（wLC）：

wEE= m1/ m2×100%；wLC= m1/ (m1+ m3)×100%。

式中， m1为胶束中白藜芦醇的质量，m2为加入的白藜芦醇质量，m3为mPEG-PLA-PHis共聚物的质量。

2.4 优化试验

2.4.1 实验设计

基于单因素实验结果，选择载体-药物质量比（X1）、成膜温度（X2，℃）和水化温度（X3，℃）作为考察因素，包封率（Y1，%）和载药量（Y2，%）作为为考察指标。根据星点设计原理，设计三因素五水平的实验方案[12-14]，各因素水平取值表见表1，试验安排和结果见表2。

2.4.2 模型拟合

根据上述优化试验结果，应用Design Expert V 8.0.6.1软件进行拟合，二次多项式拟合回归方程如下：

Y1= 90.14+5.04X1+5.37X2+9.21X3+1.31X1X2-3.98X1X3+4.35X2X3-X12-8.67X22-10.77X32(R2=0.972 8，P＜0.000 1)；

Y2= 8.19-3.61X1+0.79X2+1.18X3-0.96X1X2-1.7X1X3+0.98X2X3+1.38X12-0.70X22-0.88X32(R2=0.937 5，P＜0.000 1)。

2.4.3 结果分析

考察指标的方差分析与显著性检验结果见表3、4。

由表3和表4可知，上述2个拟合方程的P值均小于0.05。X1、X2、X3、X2X3、X22、X32对白藜芦醇胶束的包封率有显著性影响；X1、X2、X3、X1X3、X2X3、X22、X32对白藜芦醇胶束的载药量有显著性，即所选择考察各指标（载体-药物质量比、成膜温度、水化温度）对白藜芦醇胶束的包封率和载药量均有显著影响。

2.4.5 三维效应面优化结果与预测

根据拟合方程，绘制对包封率和载药量影响显著的两个因素的三维效应面图（图2、3），第三个因素水平为中心点值。

根据上述优化结果，对包封率和载药量进行范围限定，预测的最优处方和工艺条件为：载体与药物的质量比为7.85∶1、成膜温度为45 ℃、水化温度为50 ℃，包封率和载药量的预测值分别为87.2%和10%，Desirability为0.935 4。

2.4.6 验证实验

按上述预测最优处方制备3批载白藜芦醇的mPEG-PLA-PHis嵌段共聚物胶束，预测与验证的包封率和载药量如表5所示。预测值与验证值的偏差分别为2.06%和1.23%，说明该方法能较好地应用于mPEG-PLA-PHis 嵌段共聚物载药胶束的处方和制备工艺优化。

2.5 载药胶束的粒径、zeta电位与形态观察

取白藜芦醇胶束溶液1 mL，置于样品池中，经平衡后测定载药胶束的粒径（图4）与zeta电位（图5）。载药胶束的平均粒径为54.13 nm，zeta电位为-12.1 mV。

采用透射电镜（TEM）观察空白胶束和载药胶束的形态。将胶束溶液稀释至适宜浓度后，滴加于铜网上，用滤纸吸去多余液体，滴加质量分数为2%的磷钨酸溶液。室温下自然风干，然后于透射电镜下进行观察，结果见图6。测定条件：电压为200 kV，电子束电流为102 μA。

2.6 mPEG-PLA-PHis载药共聚物胶束的体外释放行为

采用透析法考察mPEG-PLA-PHis载药共聚物胶束在pH值7.4、6.5和5.0的10 mmol·L-1磷酸盐缓冲液（含体积分数为0.5%吐温80，）中的释放行为。精密移取适量的载药胶束溶液，置于透析袋（MWCO=1.4×104）中，用细线将透析袋两头系紧，放入锥形瓶中，然后加入释放介质100 mL。于(37±2.0) ℃恒温振荡器内测定药物释放，转速为100 r·min-1。分别于15、30 min及1、2、4、6、8、10、12 h取样，取样量为2.0 mL，同时补加相同温度的新鲜释放介质。样品经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液按“2.2”条方法进行HPLC分析。按下式计算白藜芦醇的累积释放度（Er/%）。绘制的释放曲线如图7所示。

式中，Er为累积释药百分比，Ve为取样量（mL），ρi为第i次取样时释放介质中药物质量浓度（mg·L-1），V0为释放介质的体积（mL），mdrug为胶束中的含药量（mg）, ρm为所取样品中药物质量浓度。

与白藜芦醇溶液相比，载药胶束具有明显的缓释特征。在pH值5.0的释放介质中，6 h的累积释放量即达到90%以上，而在pH值7.4的释放介质中，24 h的累积释放量仅为 (75.01±2.84)%。随pH降低，白藜芦醇从胶束中的释放呈明显加快趋势。

3 讨论

a．本文作者采用星点设计-效应面法优化载白藜芦醇mPEG-PLA-PHis胶束的处方和制备工艺，得到优化模型。研究结果表明，成膜温度和水化温度对载药胶束包封率有显著影响。成膜温度对包封率的影响存在极值，在最佳成膜温度以下，随温度降低，包封率降低，其原因可能是当成膜温度较低时，聚合物黏度较大，难以与药物形成均匀的薄膜。在胶束载体的玻璃化温度附近，疏水嵌段的黏度最小，分子链最易产生移动。水化时，药物与聚合物材料的相容性较好，药物分子容易进入聚合物形成疏水内核，因此包封率较高。本实验的最佳成膜温度为 45 ℃，稍高于玻璃化温度，与文献报道相符[15]。胶束的包封率随水化温度的升高而增加，其原因在于共聚物的分子随温度升高流动性增加，有助于共聚物分子相互聚集形成胶束结构，此外共聚物分子的疏水嵌段形成的内核在高温下的流动性也会增加，有助于白藜芦醇分子进入胶束内核，从而实现载药。文献研究表明，胶束的形成过程中温度可稍高于聚合物的玻璃化温度，有助于获得较高的包封率和载药量[16]。在优化实验的考察因素选择上，作者首先通过单因素试验，考察了非连续变量成膜溶剂和水化介质，确定乙腈为成膜溶剂，磷酸盐缓冲液（pH值为7.4，浓度为10 mmol·L-1）为水化介质。乙腈的沸点较甲醇和四氢呋喃等有机溶剂均高，在减压蒸发下挥发速度适中，有利于白藜芦醇和载体形成均匀的薄膜。以浓度高的磷酸盐缓冲液作为水化介质时，制得的胶束具有较低的包封率和载药量，原因可能是溶液中离子强度过高，在一定程度上影响载药胶束粒子动力学稳定性，故而选择10 mmol·L-1、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液作为水化介质。

b．载药胶束的pH触发释放对于胶束递送系统具有十分重要的意义。在静脉注射进入体内后，胶束将经历一系列的环境变化，包括稀释、pH值和盐浓度的变化等。作为药物载体，胶束在到达靶细胞之前应保持药物没有明显的泄露，这就要求胶束在生理环境下具有良好的稳定性。同时为了增加靶部位的游离药物浓度，要求胶束在肿瘤组织中迅速释药。mPEG-PLA-PHis载药胶束的在中性条件下（pH值7.4）药物释放呈明显的缓释特征，表明载药胶束稳定性良好，药物泄漏率低。随介质pH值降低，PHis嵌段中咪唑基发生质子化，使PHis嵌段发生疏水-亲水的变化，胶束结构受到破坏，从而药物从胶束的疏水性内核中快速释放，在pH值5.0介质中，白藜芦醇累积释放量达90%以上，释放较完全。释药结果表明，载药胶束在肿瘤细胞弱酸性环境中（例如细胞内涵体）可快速释放药物，同时借助聚组氨酸嵌段介导的内涵体/溶酶体逃逸实现药物的胞浆递送[17]，从而显著提高胶束载体的药物靶向递送效率。

4 结论

采用星点设计-效应面法对载白藜芦醇的mPEG-PLA-PHis胶束的处方和工艺进行优化，预测结果较为准确。最佳条件下制备的载药胶束具有较高的包封率和载药量，具有明显的pH敏感性。预期白藜芦醇mPEG-PLA-PHis胶束作为抗肿瘤干细胞靶向递送系统具有一定的靶向性。

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The preparation and in vitro evaluation of resveratrol-loaded pH sensitive copolymeric micelles

ZHAO Haixia, CHANG Qi, DONG Liyan, QIAO Mingxi*

(School of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang110016,China)

ObjectivesTo optimize the preparation process of resveratrol-loaded mPEG-poly(L-lactic acid)-poly(L-histidine) (mPEG-PLA-PHis) micelles, and to study the physicochemical properties of the drug loaded micelles.MethodsThe polymeric micelles containing resveratrol were prepared by film dispersion method. The formulation and preparation process for resveratrol-loaded micelles was optimized by central composite design-response surface method with drug loading efficiency and drug loading content as indexes. Dialysis method was employed to evaluate thein vitrorelease of resveratrol-loaded micelles.ResultsThe resveratrol-loaded micelles prepared according to the optimized results showed average particle size of 54.13 nm, entrapment efficiency of (90.69±1.87)% and drug loading of (10.25±0.64)%. Thein vitrorelease of resveratrol-loaded micelles suggested that the micelles showed pH responsive drug release.ConclusionsThe formulation and preparation process of resveratrol-loaded mPEG-PLA-PHis micelles have been optimized by central composite design-response surface method. The resveratrol-loaded micelles have been demonstrated as good entrapment efficiency and loading content as well as pH responsive drug release.

pharmaceutics; polymeric micelles; central composite design; resveratrol; pH sensitive

R 94

A

（2017）02–0021–11

10.14146/j.cnki.cjp.2017.02.001

(本篇责任编辑：赵桂芝)

2015-06-10

赵海霞(1990-), 女(汉族), 黑龙江七台河人, 硕士研究生, Email zhaohaixia1219@163.com ; *通讯作者：乔明曦(1976-), 男(汉族), 辽宁盘锦人，副教授, 博士, 主要从事智能高分子材料及缓控释给药系统的研究, Tel. 024-23986308, E-mail qiaomingxi@163.com。