溶菌酶脂质立方晶冻干粉末的制备及性质研究

刘艺宁, 孙艳辉, 王振杰, 刘洪卓

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

溶菌酶脂质立方晶冻干粉末的制备及性质研究

刘艺宁, 孙艳辉, 王振杰, 刘洪卓*

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

目的通过对脂质立方晶冻干粉末性质的考察，探索冷冻干燥技术用于制备脂质立方晶粉末的可行性。方法用薄膜分散法制备溶菌酶脂质立方晶，经冷冻干燥技术制备立方晶粉末。采用蛋白活性保护为优化指标，筛选冻干保护剂及其用量，确定最优处方；测定冻干前后载药脂质立方晶的粒径、PDI、zeta电位和药物包封率及活性变化，同时经小角光散射和偏光显微镜分析冻干前后立方晶结构。以冻干后样品的休止角和压缩度评价样品流动性。结果以甘露醇为冻干保护剂，且保护剂与脂质用量质量比为5∶1时，载药脂质立方晶冻干前后粒径、PDI、zeta电位、包封率及活性均没有明显变化；小角光散射图谱和偏光显微镜结果均说明样品为立方晶结构。脂质立方晶冻干粉末休止角和压缩度均较大。结论脂质立方晶纳米分散物可经冷冻干燥进行固体化，但冻干后粉体流动性差。

药剂学；脂质立方晶；冷冻干燥；溶菌酶；蛋白活性；小角光散射；包封率

立方晶是由两亲性小分子类脂形成的具有脂质双层“蜂窝状（或海绵状）”空间结构的聚集体，由于其独特的结构和巨大的表面积，赋予了立方晶多样化的药物装载性[1-3]。大量的研究发现，当蛋白类药物载入立方晶时，药物保持了其内在构型和生物活性，提示立方晶作为蛋白药物载体的应用潜能。但是立方液晶相的高黏度、高强度的特性限制了其用作药物载体的作用方式，为了克服这一限制，人们常常将其制成纳米分散物[4-5]。由于脂质立方晶纳米分散体系物理稳定性差、易引起脂质材料化学降解和霉变，影响药效且液体制剂不利于携带、运输、贮存，为其转化成产品带来极大的障碍[6-7]。

为提高立方晶纳米分散物的稳定性，本文作者以溶菌酶（lysozyme，LZM）为模型蛋白，采用冷冻干燥技术制备脂质立方晶干燥粉末，并对冻干后脂质立方晶的粒径及分布、zeta电位、包封率、蛋白活性、晶体结构类型和形态进行分析，研究冷冻干燥对制剂性质的影响，评价冻干后制剂的粉体学性质，为进一步的立方晶纳米分散物固体化研究提供依据。

1 仪器与材料

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器、SHZ-D(Ⅲ)循环式真空泵（巩义予华仪器有限责任公司），DZF-6020真空干燥箱、GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司），多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司），756PC紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），高速离心机（北京雷勃尔医疗器械有限公司），AUY-120电子天平（日本岛津株式会社），Zetasizer ZS90激光粒径分析仪（英国Malvern公司），BA300Pol偏光显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），LAM-0.5F真空冷冻干燥机（山东新华医疗器械股份有限公司），布鲁克Nanostar小角散射仪（中国科学院长春应用化学研究所）。

甘油单油酸酯（glyceryl monooleate，GMO，丹麦Danisco公司馈赠，批号 1141685032），普朗尼克F127（Pluronic F127，德国BASF公司)，溶菌酶（lysozyme，LZM，规格5 g，德国Merck公司），溶壁微球菌（美国Worthington biochemical公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），Triton X-100（纯度质量分数≥99.0%，北京拜尔迪生物技术有限公司，批号 9002-93-1），1,2-丙二醇（PG）、氯仿（分析纯，山东省禹王实业有限公司），甘露醇（分析纯，天津博迪化工股份有限公司），α-乳糖、右旋糖酐（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 脂质立方晶纳米分散物的制备

采用薄膜分散法制备立方晶纳米分散物[8-10]。取GMO 10 mg、F127 1.5 mg 溶于氯仿中，混匀后，50 ℃真空条件下挥去氯仿成膜后，向其内加入PG 26.8 mg，55 ℃搅拌下缓慢滴入LZM溶液0.5 mL以水化脂膜，即得LZM脂质立方晶纳米分散物。采用马尔文纳米激光粒度仪测定纳米分散物的粒径（Z-average）、多分散指数（polydispersity index，PDI）和zeta电位。

2.2 立方晶纳米分散物中溶菌酶包封率的测定

采用超滤离心法测定制剂中溶菌酶的包封率。取载LZM立方晶纳米分散物500 μL，置于超滤离心管（截留分子质量为1×106u）中，1×104r·min-1条件下离心10 min后，用BCA法测定滤液中游离LZM浓度，并根据公式计算药物的包封率：

其中，m总为加入到立方晶中的药物总质量，m游离为滤液中的药物质量；ρ总为加入体系中药物的总质量浓度，ρ游离为滤液中的药物质量浓度。

2.3 溶菌酶活性的测定

采用比浊法测定LZM的活性[11]。取溶壁微球菌冻干粉10.0 mg，加入pH值6.24 的磷酸盐缓冲溶液（PBS）适量，在研钵中研磨5 min，倒出后稀释至50 mL，制成底物溶液，使此悬浮液的A450nm在0.2～0.8内。称取LZM 10.0 mg，溶于pH值7.4的PBS中并定容至10 mL，制成1.0 g·L-1的 LZM 母液。母液经适当稀释，配制成质量浓度在1～10 mg·L-1内的系列标准工作液。待测酶液用pH值7.4 PBS将试样稀释至适当浓度，使其浓度能让反应管每分钟的 A450nm变化范围在标准曲线变化范围内。取试管2只，于第一支空白管（B）中加入底物溶液2.5 mL和pH值7.4 PBS 0.5 mL；第二支试管（S）中加入底物溶液2.5 mL，迅速加入标准酶液或待测酶液0.5 mL，立即混匀并计时。每隔半分钟用紫外分光光度计测定样品在波长450 nm下吸光度AB和AS，共读3 min。以A对时间作图，取反应最初的线性部分，计算出每分钟吸光度的减少值ΔA450nm：

以ΔA450nm对 LZM 浓度作图得随行的标准曲线，根据标准曲线，由样品ΔA450nm值计算溶液中的LZM活度。

2.4 载LZM脂质立方晶冻干粉末的制备

考察冻干保护剂乳糖、甘露醇、右旋糖酐对溶菌酶脂质立方晶纳米分散物冷冻干燥过程中的保护作用。将各种冻干保护剂按与脂质质量比5∶1，溶于制得的载药立方晶分散物中，完全溶解后，于-40 ℃预冻4 h，冻干，得载药立方晶的冻干剂。复溶后，测定LZM的活性。

考察脂质与甘露醇质量比分别为1∶2.5、1∶5和1∶7.5对冻干后LZM活性的影响，结合冻干后制剂的外观和复溶情况，确定最优处方。最优处方经复溶后，测定粒径及zeta电位，计算LZM包封率[12]。

2.5纳米分散颗粒的内部结构的表征

采用布鲁克 Nanostar小角散射仪测定小角光散射(SAXS)数据，以表征纳米分散颗粒的内部结构。测试条件为：光束的波长为λ=1.54 Å(12.0 keV)，流速为每秒1×1013个光子。在含有10个模块的Decris-Pilatus的1.84 M探测器上记录2D衍射图。测试时，将样品加入自制的样品池中后，装入SAXS仪器室内的定制样品架。每个样品的曝光时间为6 h。使用fit2D软件包分析SAXS数据。

2.6 晶体形态的测定

采用BA300Pol偏光显微镜观察加入脂质立方晶的甘露醇冻干粉末复溶后的晶体形态。

2.7 制剂的粉体学性质研究

2.7.1 休止角的测定

取冻干粉末注入一有限直径的圆盘中心上，直到粉体堆积层斜边的物料沿圆盘边缘自动流出为止，停止注入，测定圆盘上形成锥体的高度，将其与圆盘半径相比即得休止角的正切值，计算休止角。

2.7.2 压缩度的测定

取冻干粉末置于改制5 mL量筒，直至其体积读数为一特定值V初，轻敲并观察量筒中粉体的体积变化，直到体积无明显变化为止，记录下最终的体积V终。分别称量加样前后量筒质量，其差值即为所加入粉体的质量m。堆密度(bulk density，ρb)、振实密度(tap density，ρtap)与压缩度(compressibility，wC)的计算公式如下：ρb= m / V初；ρtap= m / V终；wC= (ρtap- ρb) / ρtap×100%。

3 结果与讨论

3.1 冻干保护剂及加入量对溶菌酶活性的影响

以LZM活性为评价指标，分析不同冻干保护剂对蛋白活性的影响，结果见图1。 结果表明，各种冻干保护剂对LZM保护作用优劣顺序是甘露醇、右旋糖酐、乳糖。优选甘露醇作为本实验的冻干保护剂。

在考察的范围内甘露醇的加入量对LZM的活性无影响 （图2），但因加入脂质与甘露醇比例为1∶5的样品冻干后制剂无严重塌陷现象，如图3所示，且复溶较好，所以选择脂质与甘露醇比例为1∶5作为最终处方。

3.2 粒径分布及zeta电位

由表1可知，经薄膜分散法制备的空白立方晶纳米分散物粒径分布较为均匀，粒径约为165 nm；载入LZM后，立方晶粒径明显增加，且粒子表面zeta电位由-20 mV下降为-3.5 mV，提示药物可能参与脂质立方晶结构的自组装。在载LZM纳米分散物中加入甘露醇后，粒子粒径有所下降，而冻干后立方晶分散物的粒径略微增大，约为240 nm，PDI值为0.22，说明冻干处理后制剂复溶较好。

3.3 包封率的测定

考察冻干对制剂中药物包封率的影响，由图4可知，新鲜制备的立方晶纳米分散物中药物的包封率为 (93.4±4.1)%，而冻干后包封率为(92.9±3.6)%，两组无显著差异，说明冻干对制剂中药物包载无影响。

3.4 溶菌酶活性测定

考察冻干对制剂中LZM活性的影响，结果如图5所示。新鲜制备的立方晶纳米分散物中药物的活性为(95.8±9.1)% ，冻干后 LZM 活性略有下降，为(91.3±10.4)%，但两组无显著差异，说明冻干过程对LZM活性无影响。

3.5 SAXS图谱

空白立方晶和冻干前后载LZM立方晶的SAXS图谱如图6所示。由图6可见，空白脂质立方晶纳米分散物与载LZM粒子均呈现出2组散射峰，其峰间距比近似为说明此时样品为Pn3m和Ia3d型混合立方液晶[13]，但Ia3d型散射信号较弱；冻干粉末复分散后粒子呈现出4个典型散射峰，其峰间距比为，说明该样品的晶格类型为仍为Pn3m，也属立方液晶，说明冻干后制剂立方晶结构无显著变化。

3.6 偏光显微镜图

偏光显微镜下观察样品的结果如图7所示，甘露醇粉末为针状晶体（图7A），加入脂质立方晶后经冻干处理复分散后未见任何双折射现象（图 7B）。由于立方晶具有等向性，所以在偏光显微镜下无双折射现象，进一步佐证同步SAXS试验的结果[14]，提示甘露醇参与了立方晶自组装，这可能是加入甘露醇后立方晶纳米分散物粒径改变的根本原因。

3.7 粉体流动性测定

休止角和压缩度是衡量粉体流动性的主要指标，休止角越小，流动性越好，一般认为小于 30°的粉体流动性好， 而小于40°的粉体能够满足生产过程的要求。压缩度是密度由最松密度变为最紧密度的减少程度，其值在20%以下的粉体流动性较好，随着压缩度增大粉体的流动性下降，当压缩度达到 40%～50%时粉体将很难从容器中自动流出。实验考察了以乳糖、甘露醇、右旋糖苷为冻干保护剂的冻干粉末的休止角、堆密度、振实密度、压缩度，结果见表 2。选用不同载体的脂质立方晶冻干粉末的粉体流动性均较差。

4 结论

作者通过对脂质立方晶冻干粉末理化性质的研究，探讨了载蛋白类药物脂质立方晶经冻干制备固体化的可行性。结果表明，所得冻干制剂中立方晶结构不变，易复溶且分散性好，冻干前后药物的包封率均高于90%，冻干过程对制剂中包载的溶菌酶活性无影响，为工业生产立方晶纳米分散物冻干品提供了参考。但所得的脂质立方晶粉体流动性较差，这些问题还有待解决[15]。

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Preparation of lysozyme loaded cubosome freeze-dried power and properties research

Liu Yining, Sun Yanhui, Wang Zhenjie, Liu Hongzhuo*

(School of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang110016,China)

ObjectiveTo explore the feasibility of preparation of cubosomes freeze-dried power using lyophilization technology by investigating the physicochemical properties of cubosome freeze-dried power.MethodsThe lysozyme (LZM) loaded cubsome nanocarriers were prepared by film dispersion method and then dried by lyophilization technology. With the activity of protein as optimizing index, the lyoprotectant and its dosage was chosen for the optimal formulation. The changes in Z-average, PDI, zeta potential, encapsulation efficiency and activity of LZM before and after lyophilization were compared. Structure confirmation were characterized using small angle X-ray scattering (SAXS) and polarized light microscopy, respectively. The flowability of freeze-dried power was evaluated with compressibility and angle of repose.ResultsWith mannitol (the mass ratio with lipid 5∶1) as lyoprotectant, the prepared LZM-loaded cubosomes before and after lyophilization had no obvious changes of Z-average, PDI, zeta potential, encapsulation efficiency, activity. The freeze dried power obtained in the present work indicated the formation of cubic mesophase in the prepared power based on the data from SAXS spectrum and polarized light microscopy. The repose angle and the compressibility of cubosomes freeze-dried power were both high.ConclusionsCubosome nanoparticle can be solidified by lyophilization, however, the flowability of the freeze-dried power is poor.

pharmaceutics; cubosome; lyophilization; lysozyme; protein activity; SAXS; encapsulation efficiency

R94

A

（2017）02–0032–09

10.14146/j.cnki.cjp.2017.02.002

(本篇责任编辑：赵桂芝)

2016-05-16

刘艺宁(1987-), 女(满族), 辽宁沈阳人, 硕士研究生, E-mail eveningliu@126.com; *通讯作者: 刘洪卓(1979-), 女(汉族), 辽宁沈阳人, 副教授, 博士, 硕士生导师, 主要从事治疗药物性耳聋靶向纳米制剂的研究, Tel. 13236637187, E-mail bby_1979@163.com。