盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片的药动学研究

刘巍巍，王淑君*，李 研

（1．沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016；2. 辽宁格林生物药业集团有限公司，辽宁 沈阳 110164）

盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片的药动学研究

刘巍巍1，王淑君1*，李 研2

（1．沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016；2. 辽宁格林生物药业集团有限公司，辽宁 沈阳 110164）

目的建立测定比格犬血浆中罗沙替丁浓度的高效液相色谱法，利用建立的方法研究比格犬服用盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片及缓释胶囊后的药物动力学特征，进行生物等效性评价。方法利用液液萃取法提取血浆中罗沙替丁，采用高效液相色谱法，流动相为水-乙腈-三乙胺-醋酸，色谱柱为 C18柱，内标为咖啡因，测定比格犬分别服用盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片及缓释胶囊后血浆中的血药浓度。结果血浆中罗沙替丁的质量浓度在100～6 000 μg·L-1内呈良好的线性关系，日内与日间精密度均小于 15%，回收率在 72.8～76.7%内。比格犬分别口服盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片150 mg及市售盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释胶囊150 mg后，其ρmax分别3 032 μg·L-1和3 234 μg·L-1； AUC0→t分别为1.462 8×104μg·L-1·h和1.446 4×104μg·L-1·h；AUC0→∞分别为1.609 6×104μg·L-1·h和1.576 3×104μg·L-1·h ，t1/2分别为3.21 h和3.16 h。结论应用高效液相色谱法成功的对比格犬分别口服盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片及缓释胶囊后的生物等效性进行评价，自制的盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片与市售缓释胶囊生物等效。

药剂学；生物等效性；高效液相色谱法；盐酸罗沙替丁醋酸酯；液液萃取法

盐酸罗沙替丁醋酸酯是临床上广泛应用于胃及十二指肠溃疡的H2受体拮抗剂。盐酸罗沙替丁醋酸酯为前体药物，在体内它通过小肠、血浆和肝脏的脂化作用，迅速转化成其活性代谢物罗沙替丁，在口服给药后的血浆样品不能检出，因此，所有的药动学研究均是检测生物样品中罗沙替丁的含量来实现[1-2]。罗沙替丁是盐酸罗沙替丁醋酸酯的初级代谢产物，具有高效的 H2受体拮抗作用。早期的出版物中描述了多种盐酸罗沙替丁醋酸酯生物样品分析的方法，包括气质联用、高效液相色谱、液质联用[1-8]。因为高效液相色谱法操作简便，其灵敏度及适用性可以满足生物样本分析的要求，所以作者采用高效液相色谱法进行血浆中罗沙替丁浓度的测定。

本论文中描述了一种简便的高效液相色谱法，将其用于检测血浆中罗沙替丁的浓度，其具有较宽泛的线性范围（100～6 000 μg·L-1），以及良好的精密度和准确度。利用这一方法对自制的盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片及市售的盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释胶囊进行了生物等效性研究，其符合中国食品药品监督管理局的指南要求，二者生物等效。

1 仪器与材料

岛津15C高效液相色谱仪（紫外检测器，日本岛津公司），快速混匀器（上海精科实业有限公司）、氮吹仪（沈阳杰龙仪器有限公司）。

盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释胶囊（规格 75 mg，日本脏器制药株式会社，批号 E585A），盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片（规格 75 mg，自制，批号 20150401），罗沙替丁草酸盐标准品（北京联本医药化学技术有限公司，批号 140801），咖啡因标准品（中国食品药品检定院），乙腈（色谱级，天津康科德科技有限公司），其他试剂及溶剂（分析纯，市售）。

比格犬6只，雌雄各半，1岁龄，体质量13～15 kg，沈阳药科大学动物实验中心提供，合格证号 SCXK(辽)2009-0005。

2 方法

2.1 储备液及标准液的配制

罗沙替丁及咖啡因储备液用纯化水配制成0.1 g·L-1。罗沙替丁储备液连续稀释制得质量浓度分别为1、2、4、8、15、30和60 mg·L-1的工作标准液。向空白血浆中分别加入不同质量浓度的罗沙替丁工作标准液，得到血浆中药物质量浓度分别为100、200、400、800、1 500、3 000和6 000 μg·L-1的样品，制得标准曲线。用同样的方法制得质量浓度分别为200、800及6 000 μg·L-1的质控样品。咖啡因（内标物）用纯化水稀释至最终质量浓度为3 000 μg·L-1的内标溶液。所有的溶液在4 ℃冰箱中冷藏保存。

2.2 样品的制备及萃取步骤

取出经冷冻保存的血浆，室温下溶化，精密吸取100 μL置于4 mL试管中，分别加入内标溶液10 μL、甲醇水溶液50 μL（甲醇-水体积比1∶1）和pH值11的磷酸盐缓冲液100 μL，再加入正己烷-二氯甲烷-异丙醇（体积比30∶1∶1.5）萃取溶剂3 mL，涡旋混合10 min，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上层有机相置于干净试管中，50 ℃氮气流下吹干。残渣加入流动相100 μL，涡旋5 min复溶[2,6-7]，得供试液。

2.3 液相色谱条件

色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40 ℃：检测波长：274 nm：流动相：乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(体积比17.5∶82.5∶0.5∶0.25)：流速：1 mL·min-1：进样量：20 μL，内标：咖啡因[3,5]。

2.4 方法学验证

方法学验证按照国家食品药品监督管理局《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》的要求进行。

2.4.1 特异性、标准曲线与定量范围、精密度与准确性试验

方法特异性试验：考察6个不同个体的空白血浆色谱图、空白血浆样品外加罗沙替丁及内标的色谱图（质量浓度3 000 μg·L-1）以及用药后的血浆样品色谱图，记录罗沙替丁及内标物的保留时间分别4.7 min和5.6 min，二者的分离度大于1.5，空白血浆中内源性物质不干扰罗沙替丁及内标的测定。记录信噪比为3∶1时的样品质量浓度为最低检测限。

标准曲线的制备： 按“2.2”条方法制备样品，按“2.3”条色谱条件，对7个不同质量浓度的血浆样品进行分析，用加权最小二乘法进行回归，得标准曲线方程y=1.0×10-3ρ+3.6×10-3(R=0.994)，罗沙替丁峰面积与内标峰面积的比值与血浆中罗沙替丁质量浓度在100～6 000 μg·L-1内呈良好的线性关系。

精密度与准确性试验：按“2.2”条方法配制罗沙替丁质量浓度分别为200、800、6 000 μg·L-1的低、中、高3种质量浓度的质控样品，每个质量浓度连续测定3 d，每天每个质量浓度进行5个样本分析。低、中、高3种质量浓度的批内相对标准差及批间相对标准差均应小于15%，在定量下限附近相对标准差应小于20%，准确度均应在85%～115%内，定量下限应在80%～120%内。

分别制备2组罗沙替丁质量浓度分别为200、800、6 000 μg·L-1的低、中、高3种质量浓度的质控样品，A组样品向空白血浆加入罗沙替丁标准液，按“2.2”条方法进行样品处理，每个质量浓度进行5个样品分析。B组样品取空白血浆，除不加内标外按“2.2”条方法进行样品处理，在吸取上层有机相并氮气吹干后，分别加入低、中、高3种质量浓度的标准溶液（相当于原空白血浆中含罗沙替丁质量浓度为分别200、800、6 000 μg·L-1的低、中、高3种质量浓度），再加入内标溶液10 μL，涡旋混合，流动相复溶，每个质量浓度进行5个样品分析。每组样品的每种质量浓度的5个样品其罗沙替丁与内标的峰面积分别取平均值，3种质量浓度的A、B两组处理方法的罗沙替丁峰面积比值(A/B)即为罗沙替丁的提取回收率。同法求出内标物咖啡因的提取回收率。

2.4.3 稳定性试验

通过对不同储存时间和温度的罗沙替丁血浆样品进行分析来评估其稳定性。将制备后的低（200 mg·L-1）、中（800 mg·L-1）和高（6 000 μg·L-1）3种质量浓度的血浆样品在不同的条件下放置，每个条件每一质量浓度3个样品。将储存后的样品按“2.2” 条方法进行处理，所得样品与内标的峰面积比，与新鲜配制的血浆样品处理后的峰面积比进行比较，计算其百分率。

短期稳定性：将罗沙替丁血浆样品于室温下放置4 h后，进行分析；长期稳定性：将罗沙替丁血浆样品于-20 ℃冰箱中冷冻保存，放置21 d后取出进行分析；处理后样品稳定性：将处理后罗沙替丁血浆样品于室温放置8 h后进行分析。

2.5 生物等效性研究

采用双周期交叉试验设计，将6只成年健康Beagle犬随机分成2组，每组3只，空腹抽取空白血4 mL，每组分别给予自制盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片及市售盐酸罗沙替丁缓释胶囊150 mg，给药后分别于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h取血3 mL，血样用肝素抗凝，离心取血浆，于-20 ℃冰箱中冷冻保存。间隔两周后，交叉给药，同时间点采血。

将血浆样品按“2.2”条方法进行处理，分析不同时间点的血浆药物浓度。采用统计矩的非隔室动力学理论对6条犬的血药数据进行处理，求算药动学参数。其中ρmax和tmax由原始血药质量浓度经时数据读出，根据药时曲线消除相中末段直线部分的4个试验点的血药质量浓度对数与时间进行线性回归，由直线的斜率求出清除速度常数 ke，半衰期 t1/2由 0.693/ke求得，药时曲线下面积 AUC0→t采用梯形法计算，依据公式 AUC0→∞=AUC0→t+ρt/ke计算得到 AUC0→∞。依据公式Fr（%）=（AUC0→t）t/（AUC0→t）R×100%，计算得到与参比制剂同剂量的自制缓释片的相对生物利用度Fr。通过对主要药动学参数AUC0→t、AUC0→∞及ρmax进行统计分析，采用方差分析、双单侧t检验法和90%置信区间法进行生物等效性评价。

3 结果与讨论

3.1 特异性、标准曲线、精密度和准确度试验结果

特异性试验：图1分别为空白血浆色谱图、空白血浆样品外加罗沙替丁及内标的色谱图（质量浓度为3 000 μg·L-1）以及用药后的血浆样品色谱图。结果表明，罗沙替丁保留时间为4.7 min，内标物的保留时间为5.6 min，二者具体较好的分离度。空白血浆中内源性物质不干扰罗沙替丁及内标的测定。

值得关注的是，据临床报道，SHLI有致速发型过敏反应的不良反应［19-20］，似乎与本研究SHLI抗过敏作用相矛盾。事实上，本课题组正是在研究SHLI致过敏的不良反应过程中发现其对肥大细胞脱颗粒具有良好的抑制作用［6，21］。药物被机体作为异物识别而发生过敏反应与其可治疗过敏性疾病二者之间并不矛盾。正如作为抗过敏的一线药物酮替芬，其使用注意事项中也明确提出“对本品过敏症禁用”。需要说明的是，SHLI通过线粒体钙单向转运体活化发挥其强大的肥大细胞稳定作用［6］给其致过敏的研究带来了困难。在研究设计SHLI致敏性实验时，需要排除前者的干扰，这是研究过程中必须注意的。

标准曲线制备：通过分析100～6 000 μg·L-1内7个不同质量浓度的血浆样品，用加权最小二乘法进行回归，得标准曲线方程y=1.0×10-3ρ+3.6×10-3,R=0.994。结果表明，罗沙替丁峰面积与内标峰面积的比值与血浆中罗沙替丁质量浓度在100～6 000 μg·L-1内呈良好的线性关系，最低检测限为100 μg·L-1。

精密度与准确度试验：分析方法的日内精密度及日间精密度结果见表1。日内精密度在2.99%～7.93%内，日间精密度在 7.32%～10.73%内，日内及日间的准确度分别为 96.73%～100.21%和97.41%～102.07%。所有结果均符合分析方法的精密度及准确度要求。

3.2 提取回收率试验

罗沙替丁质量浓度为200、800和6 000 μg·L-1时，其回收率分别为73.7%、72.8%和76.1%。3种质量浓度回收率的RSD值分别为6.16%、5.97%和5.84%。内标物咖啡因的血浆样品回收率为74.6%，RSD值为5.8%。说明药物和内标的回收率均符合分析要求。

3.3 稳定性试验

将制备后的低（200 μg·L-1）、中（800 μg·L-1）、高（6 000 μg·L-1）3种质量浓度的血浆样品在不同的条件下放置后，进行提取分析，室温下放置4 h后，罗沙替丁3种质量浓度的稳定性数据为分别为(102.5±5.5)%、(100.9±5.4)%和(103.9±2.8)%；于-20 ℃冰箱中冷冻保存，放置21 d并冻融3次后，罗沙替丁3种质量浓度的稳定性数据为(97.0±9.5)%、(101.6±3.5)%和(102.3±3.2)%；处理后血浆样品室温放置8 h后，罗沙替丁3种质量浓度的稳定性数据为(102.2±3.3)%、(98.6±0.5)%和(96.6±3.1)%。因此，罗沙替丁血浆样品在室温下短期存放4 h以及冷冻长期保存21 d天均稳定，处理后血浆样品室温存放8 h稳定。

3.4 生物等效性研究

应用建立的检测方法进行盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片的生物等效性研究，应用DAS 2.0软件对所测数据进行处理，采用主要药代参数经对数转换后以多因素方差分析进行显著性检验，然后用双单侧t检验和计算90%置信区间的统计方法来评价和判断药物间的生物等效性。表 2显示了口服盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片自制样品及对照药品后的药动学数据，经对数转换后受试制剂的AUC0→24在参比制剂的80%～125%内，受试制剂的AUC0→∞在参比制剂的80%～125%内，受试制剂的ρmax在参比制剂的75%～133%内，两药生物等效。

4 结论

作者建立了一种液-液萃取后高效液相色谱检测的方法，用于测定比格犬血浆内罗沙替丁的含量，其具有适合的灵敏度、精密度及准确度。同时该分析方法简便，在进行大量的生物样品分析时，方便快速。应用该方法进行了自制盐酸罗沙替丁醋酸酯缓释片与市售缓释胶囊的生物等效性分析，其结果符合中国食品药品监督管理局相关指南的要求，二者生物等效。

参考文献：

[1] 文爱东, 毕琳琳, 罗晓星, 等. 注射用盐酸罗沙替丁醋酸酯在健康人体内的药动学研究[J]. 中国新药杂志, 2006, 15(18): 1589-1592.

[2] SHIN Beom-soo，JIN Won-choi，BALTHASAR JOSEPH P, et al. Determination of roxatidine in human plasma by liquid chromatography/electrospray mass spectrometry and application to a clinical pharmacokinetic study[J] . Rapid Commun Mass Spectrom, 2007, 21: 329–335.

[3] 吕秀玲, 吴琼珠, 柯学. 盐酸罗沙替丁醋酸酯胃内滞留片的制备及体外释药特性[J]. 中国药科大学学报, 2011, 42(5): 418-422.

[4] 靳海明, 杨美燕, 高春生. 口服缓控释制剂体外评价方法研究进展[J]. 中国新药杂志, 2013, 22(2): 196-200.

[5] 廖鹏, 陈燕忠, 吕竹芬, 等. 盐酸罗沙替丁醋酸酯脉冲控释微丸体外释放考察[J]. 中国医院药学杂志, 2010, 30(21): 1819-1823.

[6] RYUA Ju-hee, CHOIA Sang-jun, LEEA Heon-woo ,et al. Quantification of roxatidine in human plasma by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass pectrometry: Application to a bioequivalence study[J]. Journal of Chromatography B, 2008, 876(1): 143–147.

[7] 任爽. 血浆中罗沙替丁和TD0232定量分析方法研究和应用[D]. 沈阳: 沈阳药科大学, 2006: 6-17.

[8] MAHESHWARI A, SHARMA M, SHARMA D. Investigation of the blinding of roxatidine acetate hydrochloride with cyclomaltoheptaose（β-cycledextrin）using IR and NMR spectroscopy[J]. Carbohydrate Research, 2011, 346: 1809-1813.

The pharmacokinetics study of roxatidine acetate hydrochloride sustained-release tablets

LIU Weiwei1, WANG Shujun1*, LI yan2

(1.School of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang110016,China; 2.Liaoning Green Biological Pharmaceutical Group Co.,Ltd.,Shenyang110164,China)

ObjectiveTo establish the method of determining the plasma concentrations of roxatidine in beagle dogs using high-performance liquid chromatography (HPLC). To study the pharmacokinetics of roxatidine acetate hydrochloride sustained-release tablets and capsules in beagle dogs, and evaluate the bioequivalence.Methods Liquid-liquid extraction method was used to extract roxatidine. The plasma concentrations of roxatidine in beagle dogs were detected by HPLC. The mixed solution of water, acetonitrile, triethylamine and acetic acid was selected as mobile phase using C18chromatographic column, and caffeine was chose as the internal standard.ResultsThe serum concentration of roxatidine from 100 to 6 000 μg·L-1showed good linear relationship. The precisions of intra-and inter-day were both less than15%. The recovery was between 72.8 and 76.7%. Pharmacokinetic studies of roxatidine sustained -release tablets (the dose was 150 mg) and roxatidine sustained -release commercial capsules (the dose was 150 mg) were conducted after oral administration in beagle dogs. ρmaxwere 3 032 μg·L-1and 3 234 μg·L-1, AUC0→twere 1.462 8×104μg·L-1·h and 1.446 4×104μg·L-1·h, AUC0→∞were 1.609 6×104μg·L-1·h and 1.576 3×104μg·L-1·h, t1/2were 3.21 h and 3.16 h, respectively.ConclusionsHPLC method has been applied successfully on the bioequivalence evaluation for oral roxatidine sustained-release tablets and capsules in beagle dogs. It is concluded that the self-made sustained-release tablets and commercial capsules are biological equivalent.

pharmacokinetics; bioequivalence; high-performance liquid chromatography; roxatidine; liquid-liquid extraction method

R94

：A

（2017）02–0041–07

10.14146/j.cnki.cjp.2017.02.003

(本篇责任编辑：赵桂芝)

2015-08-26

刘巍巍(1975-), 女(汉族), 辽宁沈阳人, 硕士研究生, E-mail 505282254@qq.com; *通讯作者: 王淑君(1972-), 女(汉族), 辽宁沈阳人, 教授, 博士, 主要从事药物制剂研究, Tel. 024-23986360, E-mail 1252116911@ qq.com。