Caspase在视网膜缺血再灌注损伤中表达及中药调控研究进展

张启燕 何凤娟 张富文 李强

·综述·

Caspase在视网膜缺血再灌注损伤中表达及中药调控研究进展

张启燕 何凤娟 张富文 李强

视网膜缺血再灌注损伤是临床常见疾病病理改变,其发病机制还在研究中,但细胞凋亡是视网膜缺血再灌注损伤中神经细胞死亡的主要形式,caspase家族是一组含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,在细胞凋亡过程中发挥重要作用。文章就caspase在视网膜缺血再灌注损伤中表达及中药调控综述如下。

视网膜缺血再灌注损伤; 细胞凋亡; Caspase; 中药

视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia - reperfusion injury,RIRI)是指在缺血的基础上恢复血流灌注后,视网膜损伤持续加重的现象。临床上很多疾病如糖尿病视网膜病变、视网膜中央/分支动脉阻塞、青光眼高眼压状态等都可引起视网膜缺血再灌注损伤。

1 视网膜缺血再灌注损伤中细胞凋亡与caspase表达

视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia - reperfusion injury,RIRI)是指在缺血的基础上恢复血流灌注后,视网膜损伤持续加重的现象。由于视网膜缺血再灌注损伤机制较为复杂,临床研究发现,视网膜缺血后恢复血流供应,部分视网膜细胞的解剖机构及生理功能不但无法完全恢复,还有可能加重损伤,引起细胞死亡,造成视力的进一步下降[1]。目前,视网膜缺血再灌注损伤的发病机制复杂,是各种因素反应的综合结果。这些因素主要有氧自由基生成、钙离子超载、一氧化氮浓度改变等,且均可以导致神经节细胞凋亡。早期的研究表明在视网膜缺血再灌注模型中,视网膜神经节细胞层和内核层存在细胞凋亡[2]。近年来的研究进一步说明了细胞凋亡与缺血再灌注损伤关系密切[3],细胞凋亡是视网膜缺血再灌注损伤中神经细胞死亡的主要形式,是视网膜神经细胞变性的最后共同途径[4]。有实验发现[5]正常大鼠视网膜组织各层未见明显的凋亡细胞,而造模成功后,于视网膜神经节细胞层、内核层、内丛状层可见明显的凋亡细胞。

1.1 细胞凋亡

细胞凋亡(apotosis)是一定生理或病理刺激的细胞程序性死亡过程[6],形态特征是细胞体积变小,胞质浓缩,核染色质固缩于边缘,DNA降解,最后形成多个凋亡小体而被吞噬[7-8]。细胞凋亡受特异性复合物调节,如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶等,caspase是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶,细胞凋亡的最后实施是通过caspase的激活而实现的[9]。

1.2 caspase家族

caspase于1990年代中期发现,是一组特异性切割天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase),在细胞凋亡过程中发挥重要作用[10-11]。caspase家族有14个成员,分为两大类:一类是凋亡启动因子,如caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10,另一类是凋亡执行因子,如caspase-3、caspase-6、caspase-7[12],构成了级联放大效应。凋亡启动因子在级联反应的上游,能在其它蛋白辅助下发生自我活化并识别和激活下游的caspase。凋亡执行因子在级联反应的下游,作用于其特异性底物并导致细胞凋亡[13]。正常情况下,caspases以非活性酶原形式存在于细胞质中,细胞接受凋亡信号后,凋亡启动因子聚集成簇而活化,然后切割凋亡执行因子,使之成为有催化活性的功能体[10]。

1.3 caspase在RIRI中的表达

RIRI视网膜成分的丢失涉及神经节细胞凋亡,而caspase家族是细胞凋亡的必经之路。细胞凋亡表达主要通过有3条通路,线粒体通路、死亡受体通路和内质网信号通路[7],而caspase是多条凋亡通路的汇聚点,通过活化caspase来最终启动细胞凋亡过程。因此,caspase的活化是细胞凋亡信号转导过程中的重要环节之一。3条细胞凋亡信号途径通过共用分子相互作用,相互联系,形成巨大的信息传递网。

线粒体通路 线粒体在细胞凋亡中具有重要作用,是多种细胞凋亡信号的靶点。细胞凋亡时,位于线粒体膜间隙的细胞色素C(Cytc)等促凋亡活性蛋白释放至胞浆内,在ATP/dATP存在的情况下,Cytc与凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)形成多聚复合体[7]。 此复合体通过Apaf-1氨基端的caspase募集结构域(CARD)与caspase-9原域的CARD发生相互作用,募集胞质中的caspase-9,caspase-9酶原之间因相互靠近自我剪切而活化。通过CARD 的相互作用,caspase-3和-7也被募集到Apaf-1/caspase-9复合体中,活化的caspase-9激活caspase-3和caspase-7,从而启动caspase 级联反应[14]。

死亡受体通路 该通路由死亡受体(death receptors)、Fas相关的死亡结构域(Fas associated death domain,FADD)和caspase-8 组成。来自于细胞膜外的死亡受体信号,通过死亡受体转入细胞内,死亡受体是一类跨膜蛋白,最典型的有Fas和TNFR1,死亡受体进一步活化膜上FADD,结合并活化caspase-8,活化的caspase-8形成由FasL、Fas、FADD、caspase-8组成的蛋白复合物,进一步水解procaspase-3,生成caspase-3[15]。

内质网信号途径 近来研究结果表明,内质网在控制细胞命运中起重要作用,内质网是真核细胞中蛋白质翻译合成和细胞内钙离子的储存场所,对细胞应激反应起调节作用[16]。当细胞处于长期持续的内质网应激状态时,内质网跨膜受体,主要是IRE1α、PERK,产生的信号传导可通过调节Bcl-2家族蛋白、调节内质网钙离子内而导致环境紊乱[17]。当内质网钙离子动态平衡破坏或过多蛋白积聚于内质网时,位于内质网上的caspase-12可被直接激活,同时也导致胞质中的caspase-7转移到内质网表面,进一步激活caspase-12,激活的caspase-12可进一步剪切caspase-3,而引发细胞凋亡[18]。也有研究表明caspase-4参与内质网应激[19]。

2 抑制caspase表达中药对RIRI保护的实验研究

细胞凋亡受到越来越多学者的关注,目前的实验研究表明,通过抑制caspases可以有效地保护视网膜神经节细胞凋亡,从而控制疾病的发展。最近研究较多的通过抑制caspase保护视网膜神经节细胞的中药主要有以下几种。

2.1 丹参

丹参为唇形科鼠尾草植物丹参的干燥根及根茎,在改善脑缺血再灌注损伤、血液流变学及血小板功能等方面有药理活性[20]。张铁华等[21]实验应用球后注射丹参注射液治疗兔视网膜缺血再灌注损伤,观察其对视网膜节细胞凋亡、caspase-3蛋白表达的影响,发现除1小时外,治疗组各时间点凋亡细胞数量、caspase-3蛋白表达均较对照组明显减少,作者从而得出:丹参注射液可以通过抑制细胞凋亡、抑制caspase-3表达和活化而起到对视网膜缺血再灌注损伤的保护与治疗作用。杨先梅等[22]研究大鼠视网膜缺血再灌注时,和缺血再灌注组比,丹参处理组在不同时间点Bcl-2的表达明显增强,Caspasse-3蛋白表达明显减弱,减少神经节细胞凋亡,保护视网膜。

2.2 葛根

葛根为豆科多年生落叶藤本植物葛的干燥根,主要活性成分为葛根素,葛根素具有扩张冠状血管、减慢心率、降低外周阻力和减少心肌耗氧量、抗氧化等功效[23]。李凤花等[24]研究发现葛根素可能通过部分阻断caspase-3激活的信号通路以及抑制由于白细胞浸润造成的炎性损伤,发挥其对视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。

2.3 姜黄

姜黄为姜科植物姜黄的干燥根茎,主要活性成分为姜黄素,研究表明姜黄素具有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤、抗纤维化等药理作用[25]。王赛斌等[26]研究发现姜黄素能明显减少缺血再灌注后的视网膜和视网膜毛细血管细胞凋亡,下调p53的表达,降低凋亡执行因子caspase-3酶的活性,以起到保护视网膜作用。

2.4 β-七叶皂苷钠

β-七叶皂苷钠是从婆罗子的干燥果实中提取到的一种含酯键的三萜皂苷的钠盐,具有抗炎、抗水肿、抗渗出、抗氧自由基和改善血循环等方面的作用[27]。董仲富等[28]在研究β-七叶皂苷钠对大鼠缺血再灌注损伤视网膜iNOS及caspase-2表达的影响实验中,用免疫组织化学技术检测caspase-2的表达情况,结果显示caspase-2在正常对照组大鼠视网膜中未见表达,在缺血再灌注损伤后12、24小时视网膜中表达明显增强,而β-七叶皂苷钠能下调其表达,得出β-七叶皂苷钠可能通过抑制iNOS及caspase-2的表达,从而减少视网膜神经细胞的凋亡,对视网膜起到保护作用。

2.5 厚朴酚

厚朴酚是常用传统中药厚朴的主要活性成分之一,研究证实其具有抗氧化、抗微生物、抗肿瘤等多种药理作用[29]。雷晓溪等[30]实验证实厚朴酚能抑制视网膜缺血再灌注损伤引起的神经元凋亡,其机制可能是抑制凋亡执行因子caspase-3激活,从而保护视网膜。

2.6 丹皮酚

丹皮酚是从萝摩科植物徐长卿干燥根或全草和毛茛科芍药属植物牡丹、芍药根皮中提取分离出来的活性成分,丹皮酚具有镇静、催眠、抗菌、抗炎、抗氧化、降血压等作用[31]。李洁等[32]实验表明在RIRI中存在caspase-3的参与,作者通过在实验中发现丹皮酚治疗组视网膜中的Bcl-2表达明显增强,caspase-3表达明显减弱,判断丹皮酚对于视网膜的损伤能够起到保护作用。

3 展望

caspase作为细胞凋亡过程中的关键蛋白酶,研究RIRI中神经细胞凋亡通路中的调控机制及确切作用,将为RIRI疾病的发病机制提供有力依据,为治疗提供有效的途径。我们可以抑制caspase进而抑制细胞凋亡来拯救视网膜濒死的细胞,从而改善RIRI疾病状态。虽然中药通过抑制caspase治疗RIRI有一定的疗效,目前的研究在针对RIRI疾病治疗上大多仍处于动物实验阶段,临床研究较少,缺乏必要的临床应用资料。随着科学的发展及临床研究的深入,视网膜细胞损伤及保护机制将更加明晰,RIRI机制及治疗等研究将取得更多瞩目的成果。

[1] 李漫丽.葡萄糖调节蛋白78基因转染对RIR损伤的保护作用研究[D].长春市:吉林大学第二医院,2008.

[2] Ishizuka F,Shimazawa M,Umigai N,et al.Crocetin,a carotenoid derivative,inhibits retinal ischemic damage in mice[J].Eur J Pharmacol,2013,703(1-3):1-10.

[3] 杨丹,余德立,余资江.视网膜缺血再灌注损伤的机制及药物治疗进展[J].局解手术学杂志,2012,21(5):561-563.

[4] 葛嫣然,邵宏超,王福海,等.兔视网膜缺血再灌注损伤中caspase-9的表达和雌激素对其影响[J].医学理论与实践,2013,26(17):2241-2242.

[5] 吕建红,张琦.苯甲酸雌二醇对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用及对caspase-3蛋白表达的影响[J].吉林医学,2012 33(18):3838-3839.

[6] 魏娜,贺海波,张长城,等.JNK信号通路与细胞凋亡关系的研究进展[J].中国临床药理学与治疗学,2013,18(7):807-811.

[7] 赵彦超,顾耘.细胞凋亡通路研究进展[J].现代医学,2013,41(4):285-288.

[8] Laura Lossi,Carolina Cocito,Silvia Alasia,Adalberto Merighi.Ex vivo imaging of active caspase 3 by a FRET-based molecular probe demonstrates the cellular dynamics and localization of the protease in cerebellar granule cells and its regulation by the apoptosis-inhibiting protein survivin [J].Molecular Neurodegen-eration,(2016)11:34.

[9] 葛建彬,顾锦华,李梅等银杏内酯A 对小鼠脑缺血/保护作用及其抑制NF-κB 信号通路下调p53、caspase-3 表达的机制[J].中国药理学通报,2012,28(8):1105-1110.

[10] 冯骁,田聆,黄倩.caspase-3基因表达调控研究进展[J].生命科学,2014,26(9):936-941.

[12] 秦宇,张劲松,闵晓洁,等.microRNA let-7a 调控caspase 家族影白内障发生的机制研究[J].中国医药导报,2015,12(17):5-8.

[13] McStay GP,Green DR.Measuring apoptosis:caspase inhibitors and activity assays[J].Cold Spring Harb Protoc,2014(8):799-806.

[14] 岳原亦,张扬,张一奇.caspase家族与细胞凋亡[J].综述与进展,2011,6(6):25-26.

[15] 和四梅,张丽莉,王艺磊.caspase 细胞凋亡通路及其在水生无脊椎动物的研究进展[J].生物技术通报,2013,9:54-61.

[16] 曹延萍,郝咏梅,刘青娟,等.内质网应激及其特有凋亡途径caspase-12与糖尿病大鼠肾组织固有细胞凋亡之间的关系[J].中国应用生理学杂志,2011,27(2):236-240.

[17] 李敏,林俊.细胞凋亡途径及其机制 [J].国际妇产科学杂志,2014,41(2):103-105.

[18] 赵瑞杰,李引乾,王会,等.caspase 家族与细胞凋亡的关系[J].中国畜牧杂志,2010,46(17):73-77.

[19] Valentín-Acevedo A,Sinquett FL,Covey LR.c-Rel Deficiency Increases caspase-4 Expression and Leads to ER Stress and Necrosis in EBV-Transformed Cells [J].PLoS One,2011,6(10):1-11.

[20] 马丙祥,董宠凯丹参的药理作用研究新进展[J].中国药房,2014,25(7):663-665.

[21] 张铁华,张永利,张春丽,等.丹参注射液对兔视网膜缺血再灌注损伤后视网膜节细胞凋亡和caspase-3 表达的影响[J].浙江中医药大学学报,2012,21(11):1781.

[22] 杨先梅,程辉,郭英.丹参预处理对大鼠视网膜缺血再灌注的保护作用及Bcl-2、caspase-3表达的影响[J].辽宁中医药大学学报,2015,17(8):33-35.

[23] 尹乐斌,夏秋良,赵良忠,等.葛根药理作用研究进展[J].现代农业科技,2016,4:68-69.

[24] 李风花,孟瑞华.葛根素对大鼠RIR损伤的保护作用[J].临床眼科杂志,2007,15(2):165-168.

[25] 周晶晶,郑昱辰,李明月,等.姜黄素的药理作用研究进展[J].吉林医药学院学报,2016,37(4):304-307.

[26] 王赛斌,姬斌,黄晓燕,等.姜黄素对自发性高血压大鼠缺血再灌注后视网膜细胞凋亡及p53表达的影响[J].浙江中医药大学学报,2012,36(7):798-802.

[27] 张旭朝.β-七叶皂苷钠的药理作用及不良反应分析[J].山西医药杂志,2012,41(11):1201.

[28] 董仲富,刘洪菊,魏光美,等.β-七叶皂苷钠对大鼠缺血- 再灌注损伤视网膜iNOS及caspase-2 表达的影响[J].中药材,2015,38(3):588-591.

[29] 张勇,唐方.厚朴酚药理作用的最新研究进展[J].中国中药杂志,2012,37(23):3526-3530.

[30] 雷晓溪,刘苏,鄢秀菊,等.厚朴酚对兔视网膜缺血再灌注神经元凋亡和bcl - 2、caspase - 3表达的影响[J].湖北民族学院学报,2007,14(1):14-17.

[31] 刘雁丽,韦柳成,沈振国,等.丹皮酚的药理作用、提取及含 量测定方法研究进展[J].安徽医药,2011,15(7):896-897.

[32] 李洁.丹皮酚对兔视网膜缺血再灌注后 Bcl-2、caspase-3 蛋白表达的影响[D].唐山市:河北联合大学附属医院,2014.

The expression of Caspase in retinal ischemia -reperfusion injury and the research progress of traditional Chinese medicine

ZHANGQi-yan,HEFeng-juan,ZHANGFu-wen,LIQiang

(ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075)

Retinal ischemia-reperfusion injury is a pathological changes of common clinical disease,and the producing mechanism is still in research,but apoptosis is the main form of neuronal death in retinal ischemia-reperfusion injury.Caspase family is a group of cysteine aspartic acid protease and plays an important role in the process of apoptosis.In this article,the expression of caspase and the regulation of traditional Chinese medicine are reviewed.

Retinal ischemia-reperfusion injury; Apotosis; Caspase; Traditional Chinese medicine

教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(编号：20135132120003);四川省科技厅科技创新苗子工程(编号：2016068);成都市科学技术局(编号：2014-HM01-00375-SF)

610075,四川成都,成都中医药大学

张富文,E-mail:330920118@qq.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.02.017

R774