脂质体在体外消化过程中的氧化稳定性

田蒙蒙,李 娜,魏富强,卢筠梦,韩剑众,刘玮琳

(浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江省食品安全重点实验室,浙江杭州 310035)



脂质体在体外消化过程中的氧化稳定性

田蒙蒙,李 娜,魏富强,卢筠梦,韩剑众,刘玮琳*

(浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江省食品安全重点实验室,浙江杭州 310035)

分别建立成人和婴儿体外胃、肠单独消化模型以及胃肠连续消化模型,通过检测脂质过氧化物值(POV)和硫代巴比妥酸(TBARS)反应物浓度,研究脂质体在模拟消化过程中的氧化稳定性。结果表明,脂质体在模拟人体单独胃消化过程中结构保持稳定,而在模拟小肠环境易受胰酶和胆盐的作用发生氧化,并且在模拟胃中和模拟肠中婴儿的POV和TBARS值均显著低于成人(p<0.05);在连续消化过程中,模拟婴儿胃部消化时间对其继续在小肠消化的氧化程度影响较小(p>0.05),而模拟成人胃肠连续消化产生的过氧化物量相对较多,脂质体氧化程度比较高,结构破坏较严重。

脂质体,体外消化,脂质氧化,稳定性

脂质体(Liposome)是脂类分子(类脂)的自组装体,具有一个或多个类似生物膜的双分子层,中间包覆微水相的结构,是一种被广泛研究的递送系统[1-2]。脂质体可由天然存在或人工合成的磷脂为原料制备获得,具有保护、靶向、长效、无毒等优点,且工艺相对简单、易扩大生产、供给途径多样化[3-4]。自1965年发现以来,脂质体已广泛应用于食品营养、医药、化妆品、农业等领域[5]。然而,脂质体的不稳定性和氧化降解限制了其应用[6]。前期研究表明,脂质体在模拟体外胃部消化过程中结构基本保持稳定,而在小肠消化过程中磷脂双层膜逐渐水解[7],但对脂质体在胃肠环境的氧化行为并未深入研究。另外,由于婴儿消化系统发育不完全,消化道中pH、酶含量等消化环境与成人有很大差别[8],针对脂质体在婴儿胃肠环境以及成人胃肠环境氧化稳定性的报道研究鲜见。

脂质氧化作用是发生在不饱和脂肪酸共价键上的一系列自由基反应,其产生的活性氧易使细胞膜的流动性和通透性发生改变,导致细胞结构的破坏和功能的减弱,甚至引起DNA损伤,影响人体健康[9-10]。脂质体主要壁材为磷脂,据Grit[11]描述,脂质体中磷脂的氧化主要作用在多不饱和磷脂酰基链上,同时受到磷脂分子中脂肪酸链的饱和度以及溶液中存在的离子强度的影响。而脂质体处于低酸环境如胃酸更易发生氧化反应,产物含有带负电荷的脂肪酸等物质,直接影响脂质体的包封率,也可能增加毒性[12]。因此,检测脂质体氧化代谢产物对评价脂质体的结构稳定性和食品安全性具有重要意义[13-14]。

因此,本文以通过脂质过氧化物值(POV)和硫代巴比妥酸反应物(TBARS)浓度为评价指标,分别建立婴儿及成人胃肠消化模型,系统探讨脂质体在模拟成人及婴儿胃肠道消化过程中氧化稳定性,以期研究以脂质体为营养素运载体系的食品以及药品在胃肠道消化方面的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆磷脂(P3644)、胃蛋白酶(P7000)、胰酶(P1750)、胆盐(B8631)、维生素E(T3251;≥96%)、胆固醇(C8503;≥92.5%)、吐温-80 Sigma公司;磷酸氢二钠(≥99%)、磷酸二氢钠 Aladdin公司;实验用水(Water) Milli-Q去离子水(≥98%);三氯乙酸(TCA)、碳酸氢铵、硫氰酸铵、二叔丁基对甲酚(BHT)、无水乙醇 均为分析纯。

ARA 520电子精密天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司;85-2数显恒温磁力搅拌器 江苏省金坛市江南仪器厂;R-200旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司;TQ2-312台式恒温振荡器 上海精宏实验设备有限公司;Synergy UV超纯水仪 法国 Millipore仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 婴儿及成人模拟胃肠消化液配制 模拟胃液(Simulated gastric fluid,SGF)和小肠液(Simulated intestinal fluid,SIF)的配制方法参照Liu[15]和Dupont[16]等的报道并加以改进(表1)。SGF储备液的配制:称取2 g氢氧化钠溶于约800 mL的去离子水,用0.1 mol/L HCl调节pH后定容至1 L;SIF储备液的配制:准确称取6.8 g磷酸氢二钾溶于800 mL去离子水,用0.1 mol/L NaOH调节pH后定容至1 L。

表1 婴儿与成人模拟胃肠道消化液配方

注:“/”表示不含此物质。

1.2.2 脂质体的制备 脂质体的制备采用经典薄膜分散法即Bangham法并进行改良,具体步骤为[17]:将磷脂、胆固醇、吐温-80和维生素E按质量比为6∶1∶1.8∶0.12溶解于无水乙醇并于30 ℃水浴恒温避光搅拌过夜,均匀的混合液于旋转蒸发仪抽真空除去无水乙醇(55 ℃水浴),待形成均匀薄膜后,缓慢加入磷酸盐缓冲溶液PBS(pH7.4,0.05 mol/L),在低速旋转条件下充分洗膜至少1 h,形成乳白色悬液即得脂质浓度为8 mg/mL的LF脂质体。制备过程全程避光,所得样品于4 ℃条件下避光保存。

1.2.3 体外模拟胃、肠单独消化 将脂质体与成人或婴儿SGF或SIF储备液按照1∶3(v/v)混合后,分别调节SGF混合液的pH至3(婴儿)或1.5(成人)、SIF混合液的pH至7.4,在37 ℃恒温水浴摇床中以95 r/min预热20 min。根据Kristinova等[18]的方法并做适当修改,将混合液转移至带有少许玻璃珠的注射器内,轻轻摇晃将其混合均匀(注意保持活塞和注射器管口的封闭);在注射器中预留5 mL的空气,以保证在整个氧化过程中氧气充足。将注射器放置于37 ℃恒温摇床,以95 r/min的转速混匀,避光;加入胃蛋白酶或胰酶的瞬间开始计时,每隔30 min(0、30、60、90、120 min)从注射器中取样1 mL于具塞试管中,经胃消化的样品滴加0.5 mol/L碳酸氢铵调节pH至7.0±0.5、经模拟小肠消化样品在95 ℃加热2 min使酶灭活,立刻进行指标测定。

1.2.4 体外模拟胃肠连续消化 根据Ye[19]等方法做适当修改,建立婴儿体外模拟胃肠连续消化模型。首先按照1.2.3所述进行模拟胃消化,分别在1、30、120 min取样,与配制好的婴儿或成人SIF储备液混合,然后按照1.2.3所述进行模拟小肠消化,分别在0、30、60、120 min处取样并灭酶,立刻进行指标测定。

1.2.5 硫代巴比妥酸反应物(TBARS)的测定 根据Zhang[20]的方法,取0.205 mL模拟消化后的脂质体,加入0.3 mL的2% BHT乙醇溶液和10 mL的TBA/TCA储备液,其中,TBA/TCA储备液由15% TCA(w/v)和0.375% TBA(w/v)组成。然后将混合样品置于沸水浴中煮沸15 min,取出后冷却至室温,采用紫外分光光度法测量反应产物在532 nm处的吸光值,至少重复3次实验,每次实验平行3个样品,由公式(1)计算得到TBARS值。

式(1)

其中,Abs是反应物吸光度,f是样品的稀释倍数(200),ε是吸收系数(156000 L/mol·cm),L是光路宽(1 cm),V是脂质体体积(mL),G是脂质总质量(kg)。

1.2.6 过氧化物值(Peroxide value,POV)的测定 取0.1 mL的脂质体消化样品,依次加入5 mL的96%乙醇、0.2 mL的4% BHT乙醇溶液,置于旋涡震荡器中充分混合,然后再加入0.1 mL浓度为0.4 mol/L的硫氰酸铵-乙醇溶液(2 mol/L的HCl作为溶剂)和0.1 mL浓度为4.5 mmol/L的FeSO4·7H2O(2 mol/L的HCl作为溶剂),摇匀并静置10 min后立刻在500 nm波长条件下测定吸光度,至少重复3次实验,每次实验平行3个样品。测量前样品保持在冰水浴,并且试剂需用氮气进行脱气处理。通过公式(2)计算得到POV值[18]。

式(2)

其中,ABSt是反应物吸光值,ABS0为空白溶液的吸光值,V为脂质体的体积(mL),S是标准曲线的斜率(μg),G是0.16 mL中磷脂的质量(g),55.845是铁离子的摩尔质量(g/mol),1000用于单位转换,2为校正因子。

1.3 数据统计分析

实验所得数据采用SPPS 19.0和Origin 9.0等数据处理和绘图软件进行分析作图,以p<0.01 为差异极显著,p<0.05为差异显著的判断标准。结果均以平均值±标准偏差表示。

2 结果与讨论

2.1 脂质体在模拟胃部消化的氧化稳定性

本文通过检测POV值(FTC法)和硫代巴比妥酸反应物的生成量(TBARS法)来评价脂质体氧化程度。

FTC法主要用于检测氧化初期产生的脂过氧化物,不能反映氧化终止;TBARS值主要表明氧化终端产物丙二醛的量,但不能反映氧化开始及中间状态。因此,两种方法共同使用更能全面说明脂质体在模拟胃肠道消化过程中的氧化应激效应。

由图1(a)分析脂质体在模拟胃消化的氧化程度发现,无论是成人组还是婴儿组,随着消化时间的增加,POV值变化不明显(p>0.05),略呈现先上升后下降的趋势,在1.5 h达到最大值(2.88±0.10)mmol/kg(婴儿)和(3.61±0.14) mmol/kg(成人);在整个模拟消化过程中成人环境脂质体的POV值均高于婴儿(p<0.05)。由图1(b)可知,婴儿和成人TBARS值也略有逐渐增高的趋势,成人组在1.5 h达到最大值(0.64±0.01) mmol/kg;并且婴儿TBARS值均亦比成人小。

图1 脂质体在模拟婴儿和成人胃部消化过程中POV(a)和TBARS(b)含量的变化Fig. 1 POV(a)and TBARS(b)values of liposomes during in simulated gastric infant and adult digestion

据Halliwell[21]等和Kanner[22]的研究报道,胃肠道环境中的强酸、酶、胆盐、盐离子能促进脂质的氧化。本研究发现,模拟婴儿和成人消化的POV值与TBARS总体变化不明显(p>0.05),说明胃的低酸环境影响不是很大,可能是由于胆固醇在低pH下能有效保护脂质体不受破坏,使得脂质体结构变化较小[23]。POV值随消化时间延长而出现先增大后减少的趋势,可能是由于脂过氧化物是磷脂的初级氧化产物,本身化学性质不稳定,经过一定积累后,能分解为醛、酮、酸、醇等低分子量化合物[24]。而婴儿的POV值和TBARS值都显著比成人小(p<0.05),可能是因为婴儿SGF的pH相对较高(婴儿pH3.0,成人pH1.5),pH影响反应物的反应性、溶解性和在两相间的分配以及界面电荷,从而影响脂质体的氧化稳定性。另外有研究表明,在pH为3～7之间,脂质氧化速度随pH的升高而减小[25-26];同时,婴儿胃中蛋白酶的含量较成人少,脂质体破坏小,体系中分散的氧、水溶性自由基等物质与脂肪酸链接触概率降低[27],以上因素使得脂质体在模拟婴儿环境氧化程度低于成人环境。

2.2 脂质体在模拟小肠消化的氧化

由图2(a)可知,脂质体在模拟婴儿和成人的SIF中发生不同程度的氧化。随着消化时间的延长,脂质体的POV值逐渐增大,1 h后基本保持在(6.28±0.1) mmol/kg(婴儿)和(7.32±0.06) mmol/kg(成人),TBARS值的变化趋势与POV值类似(图2(b)),消化1 h后亦基本不变,婴儿和成人保持在(0.81±0.03)mmol/kg和(1.12±0.05) mmol/kg。整个消化过程模拟成人环境的POV值和TBARS值均大于婴儿环境(p<0.05),而且氧化程度都明显高于模拟胃部。

图2 脂质体模拟婴儿和成人小肠消化POV(a)和TBARS(b)值随时间的变化 Fig. 2 PV(a)and TBARS(b)values of liposomes as a function of time during in simulated intestinal infants and adults digestion

小肠胰酶为一种混合酶,主要包括胰脂肪酶、磷脂酶A2和胆固醇酯酶,这三种酶都能导致磷脂发生水解[28]:胰脂肪酶可以水解磷脂的脂肪酸链,释放出脂肪酸和1-酰基溶血磷脂;磷脂酶A2可以破坏磷脂的磷酸二酯键生成甘油磷酸和2-酰基溶血磷脂;胆固醇酯酶类似于胆盐刺激酯酶可催化胆固醇的水解。另外,胆盐是较强的类表面活性剂,能破坏磷脂的膜结构,导致脂质体膜稳定性降低,流动性增大[29],从而使得磷脂薄膜更容易发生氧化降解。在模拟婴儿SIF中,酶和胆盐的浓度较成人低,对脂质体破坏较小,故而TBARS值和POV值均比成人SIF低(p<0.05)。再者,脂质体在SIF环境消化过程中的POV值与TBARS值均显著高于SGF环境(p<0.05),可能是因为到达肠中的脂质体受到多种酶的催化,导致脂质体氧化更加彻底。

2.3 脂质体在模拟胃和小肠连续消化的氧化稳定性

脂质体经过模拟胃部消化后进入模拟小肠继续消化,环境发生很大变化,包括酶种类、离子(胆盐)以及pH[30]。其中,pH从胃部的1.5～3.0升高到6.0～7.5,而且因不同强度电解质的存在使模拟消化环境中离子强度也发生变化[31]。因此,脂质体在模拟胃肠连续消化过程中脂质氧化程度更复杂。图3为脂质体在模拟婴儿胃肠中连续消化的POV值变化趋势。结果显示,在模拟婴儿胃中消化30 min后继续在模拟小肠消化0、30、60和120 min的POV值分别为(3.10±0.10)、(3.60±0.30)、(3.61±0.20)和(3.80±0.08) mmol/kg,变化不明显(p>0.05)。因此,随着模拟胃部消化时间的延长,继续在模拟小肠中消化的平均POV值略呈下降趋势,但总体变化不明显。

图3 脂质体在模拟婴儿胃肠连续消化过程中POV的变化Fig. 3 Changes in POV of liposomes during in simulated infant stomach-subsequent-intestine digestion

图4为脂质体在成人环境中模拟连续消化过程的POV值变化。脂质体在模拟成人胃中消化30 min后在模拟小肠消化0、30、60和120 min后的POV值分别为(2.16±0.02)、(6.01±0.09)、(6.37±0.15)和(6.54±0.40) mmol/kg,明显呈上升趋势。脂质体在模拟成人胃中消化60、120 min后又分别在模拟小肠消化30、60和120 min的平均POV值为(4.56±0.30)、(3.25±0.10) mmol/kg。由此可见,脂质体在模拟成人胃中消化相同时间,继续在模拟小肠消化初期,POV值明显升高(p<0.05),30 min之后,变化不明显。但是随着在胃部消化时间的增加继续在模拟小肠中消化,其平均POV值呈明显下降趋势(p<0.05),说明模拟成人胃部消化过程影响脂质体在模拟小肠中的氧化程度。相比图3中的POV值变化,脂质体在模拟连续胃肠消化的脂质氧化程度更激烈,氧化程度变化更明显,原因可能是模拟成人胃液中胃蛋白酶含量高、模拟成人小肠环境中胰酶和胆盐的浓度高,同时过氧化物是磷脂的初级氧化产物,经过一定积累后会继续分解,因此氧化程度较高,变化较大。

图4 脂质体在模拟成人胃肠连续消化的PV值随时间变化Fig.4 Changes in POV of liposomes as a function of time during in simulated adult digestion in SGF followed by in SIF

脂质体在模拟婴儿胃肠连续消化的TBARS变化趋势与POV值类似。由图5可知,脂质体在模拟婴儿胃中消化30、60、120 min后分别在模拟小肠消化0、30、60、120 min的平均TBARS值分别为(0.64±0.02)、(0.63±0.01)、(0.60±0.01) mmol/kg,随着在模拟胃部消化时间的延长,继续在模拟小肠中消化的平均TBARS值变化不明显(p>0.05)。此结果再次说明,在模拟婴儿胃肠连续消化过程中,脂质体在模拟胃部的消化时间,对其在模拟小肠后续消化过程中的氧化程度影响较小,产生的过氧化物量也较少,同时也表明在模拟婴儿胃肠道连续消化之后脂质体结构破坏相对较小。

图5 脂质体在模拟婴儿胃肠消化的TBARS值随时间变化Fig. 5 Changes in TBARS of liposomes as a function of time during in simulated infant stomach-subsequent-intestine digestion

图6为脂质体在模拟成人胃肠连续消化的TBARS值变化。脂质体在模拟成人胃中消化30 min后在模拟小肠消化0、30、60 和120 min的TBARS值分别为(0.54±0.02)、(1.13±0.11)、(1.16±0.05)、(1.21±0.05) mmol/kg。在模拟小肠中消化30 min的TBARS值明显高于消化0 min的TBARS值(p<0.05),而且继续在模拟小肠消化30、60、120 min的TBARS值略有增大但变化不明显(p>0.05)。再者,脂质体在模拟胃中消化60、120 min后分别在模拟小肠消化30、60、120 min TBARS值呈现下降的趋势(p<0.05),说明胃部消化过程影响脂质体在小肠的氧化。相比图5中模拟婴儿TBARS值,脂质体在模拟成人连续胃肠消化脂质氧化程度更激烈,可能是由于模拟成人SGF的pH更低、胃蛋白酶、胰酶和胆盐含量更高,脂质氧化相对彻底。

图6 脂质体在模拟成人胃肠消化的TBARS值随时间变化Fig. 6 Changes in TBARS of liposomes as a function of time during in simulated adult stomach-subsequent-intestine digestion

3 结论

胃肠是营养成分的主要消化吸收场所,通过测量模拟肠胃中脂质氧化水平,不仅可以判断脂质体在胃肠消化过程中的稳定性,还可以评价胃肠连续消化之后的过氧化物生成量。单独消化时,脂质体在模拟人体胃液消化过程中相对稳定,形成的氧化产物较少;但在模拟小肠环境中,脂质体易发生氧化。连续消化时,模拟婴儿胃部消化时间,对脂质体在模拟小肠消化过程中的氧化程度影响较小;而由于模拟成人小肠环境中胰酶和胆盐的含量比婴儿高,脂质体在模拟成人环境消化产生的过氧化物量较多,稳定性较低。该研究结果可为脂质体在胃肠道消化的安全性评价和添加入婴儿配方食品提供理论参考。

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Oxidative stability of liposomes duringinvitrodigestion

TIAN Meng-meng,LI Na,WEI Fu-qiang,LU Jun-meng,HAN Jian-zhong,LIU Wei-lin*

(Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province,School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310035,China)

Invitroseparately simulated infant gastric and intestinal model and stomach-subsequent-intestine model were established in this paper,with adult conditions as comparison. In order to evaluate the oxidative stability of liposomes during simulated digestion,the proxide value and the concentration of thiobarbituric acid reaction substances were determined. Separation digestion results demonstrated that liposomes were stable during digestion in simulated gastric environment,while they were susceptible to be oxidized in simulated intestinal environment. In stomach-subsequent-intestine study,liposomes were less affected by oxygen,low pH and enzyme. However,more peroxides were formed and more severe disruption of liposomes were detected under adult conditions due to the higher concentration of pancreatic enzymes and bile salts in the adult than those in the infant environment.

liposome;invitrodigestion;lipid oxidation;stability

2016-05-06

田蒙蒙(1991-)，女，在读硕士研究生，研究方向：食品质量与安全专业，E-mail：971468842@qq.com。

*通讯作者:刘玮琳(1984-)，女，博士，讲师，研究方向：营养物及其运载体系的生物利用，E-mail：lwl512@zjgsu.edu.cn。

国家自然科学基金青年科学基金项目(31401482)；浙江省食品科学与工程重中之重一级学科开放基金项目(JYTSP20142011)；浙江省公益技术应用研究计划项目(2016C32060)；浙江省科技创新活动计划暨新苗人才计划(1110KZN0215114G)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)22-0154-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.022