脑缺血再灌注损伤后Notch通路的激活与神经干细胞增殖机制的研究进展

李宏伟， 李 迪， 黑晓英， 丁婷婷， 候荔桉综述， 贾孟辉审校

综述

脑缺血再灌注损伤后Notch通路的激活与神经干细胞增殖机制的研究进展

李宏伟1， 李 迪2， 黑晓英1， 丁婷婷1， 候荔桉1综述， 贾孟辉3审校

Notch通路是进化过程中高度保守的信号转导通路，其激活不需要第二信使和蛋白激酶的参与，可直接收邻近细胞的信号并传导至细胞核，激活相关转录因子的表达。Notch通路广泛存在于脊椎和无脊椎动物中，参与了一系列重要的生理、病理过程。其中，脑缺血再灌注损伤后Notch通路的激活对于脑神经功能的保护作用是近年来研究的热点。本文重点对脑缺血再灌注损伤后Notch信号转导通路的激活与神经干细胞增殖之间的关系加以探讨研究，同时探讨巢蛋白(Nestin)作为神经干细胞的标记蛋白，用于神经干细胞的分离、鉴定和培养，并作为中枢神经系统损伤最早、快速应答敏感指标的分子机制。

1 脑缺血再灌注损伤与Notch通路的激活

1.1 Notch通路概述 Morgan于1917 年在突变的果蝇体内首次发现了Notch基因，并因这一基因的缺失会导致果蝇翅膀边缘锯齿状缺刻(notches) 而将这一基因命名为“Notch”[1]。Notch信号转导通路在进化过程中具有高度保守性，其广泛存在于脊椎和无脊椎动物中，不仅对细胞的增殖和分化起主要的调控作用，同时还参与了一系列重要的生理、病理过程[2]。Notch信号家族包括Notch受体、配体及其相应的细胞内信号分子，这些相关分子和体内生化过程均参与了 Notch 信号转导通路的调控[3]。迄今为止发现其受体有Notch1～4共四种亚型，而配体主要有Jagged-1/Jagged-2/Delta-like 1/Delta-like 3和Delta-like 4共五种，当跨膜受体与配体结合后进入细胞，经过γ-secretase分泌酶的剪切作用从而形成Notch信号的真正激活形式NICD(Notch intracellular domain，120KD)，同时NICD与DNA结合蛋白 CBF-1/RBP-J 结合作用于靶基因 HES-1/HES-5等，最终发挥生物学效应[4]。

1.2 脑缺血再灌注损伤后Notch通路的激活及其作用 Notch信号转导通路是进化过程中高度保守的通路，与其他信号通路不同的是其激活不需要第二信使和蛋白激酶的参与，可直接收邻近细胞的信号并传导至细胞核，激活相关转录因子的表达，不具有级联放大的特点[5]。这为Notch通路精确调控神经细胞的增殖、分化提供了理论依据。在生理情况下，大脑发育时Notch通路决定了神经细胞的命运，调节了神经干细胞的增殖、分化和凋亡[6]。在病理情况下，脑缺血再灌注损伤后Notch通路调节神经干细胞增殖、分化。Wang L等[7]，研究发现成年鼠在脑缺血、缺氧后，神经干细胞的增殖过程中，NICD 和 HES1 的表达水平是增高的，阻断 Notch 通路后，NICD、HES1 的表达减少，同时神经干细胞的增殖也明显减少。Androutsellis-Theotokis A等[8]，通过渗透泵将Notch 配体 DLL4注入 大鼠 MACO 模型中延迟性激活 Notch 通路的研究发现，不仅减少了脑缺血再灌注损伤后神经元的死亡，而且促进神经干细胞的新生和缺血后神经功缺损能的恢复。Huang等[9]通过研究发现大豆异黄酮可以使局灶性脑缺血再灌注大鼠的 Notch 信号通路激活，进而抑制大脑皮质细胞凋亡。孙芬等[10]研究发现老年人脑缺血后较正常人脑内Notch1和Jagged1的表达在SVZ区明显减少，认为激活 Notch 通路可明显减少神经元的死亡，同时能够促进神经干细胞的再生和缺血后神经功能的恢复。袁云等[11]发现黄芩苷可以明显减弱体内和被激活小胶质细胞的NF-κB、Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1表达，进而发挥对缺血后的脑保护作用。有研究者[12]用电针活化Notch信号通路，可促进海马区神经干细胞的增殖、迁移和分化，来实现对脑缺血所致神经功能缺损的防治作用。

脑缺血再灌注损伤后，由于脑组织缺血、缺氧使Notch通路被激活，激活的Notch通路不仅通过促进神经干细胞的增殖，使缺血后神经功能缺损得以恢复，而且通过激活Notch通路，促进了缺血区侧支循坏的建立，改善了脑组织的缺血、缺氧状态，有效地保护了神经功能的恢复。研究认为[13]，脑缺血再灌注后 Notch 信号通路参与了生理性血管再生，尤其对静脉和毛细血管的再生发挥着重要作用。对正常或病变血管，Notch 信号通路均可调节血管的正常发育，以及侧支循环的建成。研究表明[14]，运用他汀类药物治疗脑缺血再灌注损伤后，发现NSCs 以血管为支撑向半暗带迁移，并能上调缺血半暗带和脑动脉血管的PS1、Notch1 和 NICD 的表达，从而直接增加动脉管径和动脉的密度，来促进脑缺血后的血管再生。体外培养研究也发现[15]，Notch1可通过诱导特定细胞的选择性分化而促进血管的再生，提示激活的Notch1具有强大的自我更新细胞的作用。

2 Nestin作为脑损伤后神经干细胞增殖特异性标记物的机制探究

巢蛋白(Nestin)表达起始于胚胎早期神经前体细胞，在胚胎脑发育中呈时空序列性表达，目前主要作为神经干细胞的标记蛋白，应用于神经干细胞的分离、鉴定和培养；Nestin在中枢神经损伤后能重新表达，可作为中枢神经系统损伤的最早、快速应答的敏感指标[16]。

2.1 Nestin概述 Nestin是神经干细胞特异的生物学标记物，是最晚被识别而且是最大的中间丝，其氨基酸残基数为1821，相对分子量为240，000，在一级结构中含有307 个氨基酸组成的保守核心区，其多肽数为1 条[17]。在1990年Lendahl等[18]发现及命名了Nestin，他们通过克隆出编码Rat1401抗原的基因，该基因的结构具有一般中间丝的特征，由该基因编码的蛋白显示，其中间段-α螺旋杆结构域的氨基酸序列与已发现的其它类中间丝蛋16%～29%的同源性。但其基因的内含子位置，蛋白的N 端(头，较短，只有11 个氨基酸)、C 端(尾，较长，有479个氨基酸，且含有许多带电荷的氨基酸重复序列)以及在组织细胞的分布等方面均有别于其它五类中间丝蛋白，故被单独定为第Ⅵ 类中间丝蛋白，并将其命名Nestin。

2.2 Nestin的生理性表达 Nestin 主要位于未分化的、具有分裂能力细胞的细胞质，其表达具有严格的时空顺序；随着细胞分化成熟，Nestin 逐渐被胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经丝蛋白(NF) 等中间丝蛋白代替而停止表达[19]。在神经干细胞分化早期Nestin 表达仍成阳性，但随着其分化为神经细胞、星形胶质细胞或少突胶质细胞逐渐发育成熟，Nestin 的表达逐渐减弱[20]。目前已在胚胎期的放射状胶质细胞、神经前体细胞、成年神经前体细胞、室管膜细胞、海马神经元以及损伤诱导成的反应性星形胶质细胞等中枢神经组织中发现了Nestin的表达[21]。

2.3 病理情况下Nestin的重新表达 近年来研究发现，脑缺血、缺氧、创伤以及理化等因素均可诱导Nestin 重新表达：(1)在脑缺血大鼠大脑皮质、室管膜下区、海马[22]、缺血中心区以及周边区均有Nestin 的表达并持续2 w[ 23]。并且有人证实，局灶性脑缺血诱导Nestin 阳性反应以大脑皮质缺血区及尾壳核较显著，可持续到脑缺血后6 w，这些区域尤其是尾壳核[24]，已经证实对缺血反应敏感；②机械性大脑皮质损伤可诱导伤口周围的皮质，扣带回和胼胝体出现大量的Nestin 阳性细胞，而且Nestin 在皮质的表达呈现一个以切口为中心的梯度反应模式，可持续到术后30 d[25]；(3)一些神经毒性药物如秋水仙素，可诱导成熟胶质细胞重新表达Nestin；④低蛋白饮食可诱导Nestin 的表达[26]。

脑缺血、缺氧、创伤以及理化等因素均可诱导Nestin 表达上调。有研究表明[27]，大脑中动脉梗死(MCAO)脑组织缺血再灌注6 h 即可见少量Nestin在缺血侧室管膜上皮细胞中表达，但着色较淡，室管膜下区阳性细胞胞核肿胀，突起较短；缺血再灌注12～24 h，Nestin阳性细胞着色较6 h组加深，胞核肿胀、苏木素着色浅淡、多居边，数目逐渐增多，突起亦明显增长，多指向缺血梗死区，可见少量纤维状阳性细胞。侧脑室外侧壁下方及纹状体等处尤为明显；再灌注72 h，Nestin 阳性细胞数目明显增多，可见较多沿胼胝体长轴平行排列；至再灌注7 d时，Nestin阳性细胞数目达到高峰，呈围绕梗死区的多层分布，并可见少数Nestin 阳性细胞突起伸长、交织，但胼胝体处的Nestin阳性细胞已明显减少；再灌注14 d时Nestin阳性细胞已明显回落，纤维状细胞比例较前期有所增加，但仍明显可见突起较粗、染色较深的肥大型阳性细胞，胼胝体处已几乎无Nestin阳性胶质细胞存在。观察在再灌注各时间段对照侧室管膜上皮、室管膜下区( SEZ)、纹状体、胼胝体等部位亦有Nestin胶质细胞样表达，随再灌注时间的延长有增多的趋势，但数目较缺血侧明显为少。

3 神经干细胞增殖对脑缺血再灌注损伤后神经功能缺损的修复

传统观念认为，成年哺乳动物中枢神经系统中的神经元细胞是终级分化的神经细胞，一旦调亡或坏死，将不可能再生，其功能丧失而无法代偿。但Altman在1962年用氚标记胸腺嘧啶核苷酸提供了成年鼠海马齿状回产生新神经元的放射自显影证据，首次发现脑室下区域在出生后可产生新的细胞[28]。1992年，Reynolds等报道利用Neurosphere法成功地从成年小鼠脑纹状体内分离出具有自我更新及分裂増殖能力、并可在特定条件下诱导分化为神经元、星形胶质细胞和小突胶质细胞的神经干细胞[29～31]。这些发现打破了成年哺乳动物中枢神经系统不能再生这一传统观念。随着分子生物学的逐渐发展，神经干细胞被成功分离，进一步证实了中枢神经系统中的神经元细胞在一定的条件下可以增殖、分化。在成年哺乳动物中枢神经系统中发现神经干细胞，不仅是打破了传统的细胞生理学观念，更为脑损伤提供了新的治疗思路。

目前，在急性缺血性脑损伤的治疗中，恢复缺血脑组织的血供及促进神经干细胞增殖、分化是临床治疗的两个关键环节。恢复缺血脑组织的血供最有效的方式是溶栓疗法。2010版中国急性缺血性脑卒中诊治指南明确规定溶栓的时间窗为不超过4.5或6 h[32]。4.5 h或6 h的时间窗对于脑卒中患者来说是相当短的，有许多患者由于各方面的困难错过了溶栓的机会。因溶栓的时间窗很窄，溶栓治疗在临床中应用仍然存在很大的局限性，故促进缺血性脑损伤后神经干细胞增殖，从而修复神经功能缺损具有重要的临床价值。有大量的研究显示[33～35]，缺血性脑损伤后神经干细胞的增殖与Notch信号转到通路的激活有关，并证明Notch信号通路在诱导神经前体细胞选择继续增殖或向神经元分化上起着关键作用。

4 小结与展望

脑缺血再灌注损伤后，由于脑组织的缺血、缺氧，在进化过程中高度保守的Notch信号转导通路被激活。通过Notch通路中相关蛋白因子过表达，不仅促进了缺血区侧支循环的建立、减少了缺血半暗带神经细胞凋亡，还促进了神经干细胞增殖、分化。故Notch通路的激活有效的促进了脑缺血再灌注损伤后神经功能的恢复。目前，通过神经干细胞培养、分离和鉴定的标记物-Nestin分析检测脑缺血再灌注损伤后神经干细胞的增殖、迁移、分化。但Nestin在神经干细胞增殖、迁移、分化中的作用机制目前尚不明确；缺血性脑损伤后Notch通路的激活是否是通过作用于Nestin蛋白结构的相应部位促进Nestin的表达仍没有得到证实。因此，进一步探索作为中枢神经系统损伤的最早、快速应答敏感指标的Nestin的功能及作用机制是十分必要的。通过对Nestin蛋白促进神经干细胞增殖、分化分子生物学机制的进一步研究，必将为将来有可能人为地控制神经干细胞增殖、分化的各项因素，并对其进行定向诱导，从而为神经干细胞的定向诱导分化及临床应用提供光明的前景。另外，进一步探究Notch信号转导通路的激活与Nestin过表达的关系具有重要意义。这一关系的探讨，可以为药物通过激活Notch信号通路促进神经干细胞增殖、分化提供分子生物学依据，进而促进新型药物的诞生，提高临床疗效，也将拓宽脑损伤的治疗思路。

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1003-2754(2017)11-1033-03

R743

2017-09-05；

2017-10-15

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(1.宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004；2.武威市人民医院，甘肃 武威 733000；3.宁夏医科大学第二附属医院，宁夏 银川 750001)

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