无创产前诊断技术应用于地中海贫血的研究进展

李浩贤，孙筱放

无创产前诊断技术应用于地中海贫血的研究进展

李浩贤，孙筱放

地中海贫血是世界上最常见的单基因隐性遗传病之一，主要分为α和β两种类型，另外还有部分罕见稀有型。该类疾病在热带和亚热带地区的发病尤为显著[1]，在我国广东地区α和β地贫基因携带率均高达 10% 以上[2]。其发病机制为相关基因缺陷导致珠蛋白生成障碍引起相应的贫血症状。α 地中海贫血主要是由于在 16 号染色体上 HBA1和 HBA2 基因不同长度的缺失或点突变，导致 Hb BART’s胎儿水肿综合征和血红蛋白 H 病（Hb H 病）。对于 Hb BART’s 胎儿水肿综合征的患儿在晚期妊娠或出生后数小时内死亡[3]，而 Hb H 病的患儿出生后会出现较严重的贫血，需要给予及早的预防措施和支持治疗[4]。β 地中海贫血主要是由于在 11 号染色体上 HBB 基因点突变而导致β 珠蛋白生成障碍，引起不同程度的小细胞低色素贫血，可分为重型、中间型和轻型。对出生后重型或出现症状的中间型 β 地中海贫血患儿的治疗目前采用输血作为首选，同时辅以铁螯合剂[5]，而基因治疗和造血干细胞移植等治愈方法则实现难度较大[1]。由于重型地中海贫血患儿的治疗周期长、价格昂贵，因此加强对高风险地中海贫血胎儿的预防显得尤为重要。现阶段对该类胎儿的主要产前诊断方法是超声介导下的经腹绒毛活检术、羊膜腔穿刺术和脐静脉穿刺术以取得胎儿的 DNA 进行检测[3]，但有创性检查会造成流产、胎膜早破及宫内感染等低风险事件的出现[6]。

1 游离胎儿 DNA 的发现与应用

1969 年，Walknowska 等[7]发现最早可在 14 周孕妇的血液中检测到胎儿的淋巴细胞，这为无创产前诊断胎儿染色体异常提供了一个新方向。1997 年，Lo 的团队[8]在母亲的血清和血浆样本中发现了 SRY 基因，首次证实了游离胎儿DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的存在，为无创产前诊断提供了可能。99% cffDNA 以小于 313 bp（在 193 ～313 bp 之间）的小片段存在于母亲的循环血液中，而母源性游离 DNA 片段绝大部分大于 300 bp[9-10]。cffDNA 最早在妊娠 4～5 周时即可在孕妇外周血中检测出来[11]，并且浓度会随着孕期而增加[12]，其在孕妇血浆中的半衰期为16 min，产后 2 h 将会完全消失[13]。但是将 cffDNA 运用到临床检测仍需克服以下缺点，如：①较低的富集效率[14]；②需要在高母源性 DNA 背景下检测出低拷贝量的胎儿DNA；③当母源性 DNA 分子突变型和胎儿的相同时，将难以鉴别[15]。

cffDNA 最先用于筛查 X 染色体连锁疾病[16]和为Rh 阴性的孕妇提供产前诊断[17-19]，其准确率均达 99% 以上[20]。此后，已有团队成功利用 cffDNA 对肌强直性营养不良[21]、原发性及张力障碍 I 型[22]、亨廷顿病[23-24]、软骨发育不良[25]、先天性肾上腺皮质增生症[26]及囊性纤维化[27-28]等疾病进行无创产前诊断。2008 年，Chiu 等[29]首次将第二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）成功运用于非整倍的胎儿染色体异常无创产前检测中。随后该技术在胎儿染色体非整倍体无创产前诊断中得到广泛应用，其中对21-三体综合征筛查具有高敏感性和特异性，此外对 Patau综合征、Edwards 综合征和性染色体异常的筛查具有一定的临床意义[30-31]。

2 α 地中海贫血的无创产前诊断技术

α 地中海贫血主要以东南亚缺失型（-SEA）最为常见，纯合子的 SEA 缺失可以导致 Hb BART’s 胎儿水肿综合征。Tungwiwat 等[32]和 Pornprasert 等[33-34]采用荧光定量方法对正常、α 中间型以及巴氏水肿患胎进行区分，用特异性引物通过两步即可达到检测目的，具有方便、快速的优势，但仍需大量样本进行确认。此外，Sirichotiyakul 等[35]对野生型和缺失型地贫基因设计引物，采用 Taqman 探针进行荧光定量 PCR，通过计算 △Ct 得到有统计学意义的划分值，进一步划分患胎的诊断值，这一方法能够减少 79.2% 非患儿的侵入性检测，但令人遗憾的是该方法对区分杂合子和正常胎儿基因型仍有缺陷。Ho 等[36]和 Yan 等[37]则是采用与缺失片段相关的具有信息性的父源性 SNP（single nucleotide polymorphisms）位点和 STR（short tandem repeats）位点对巴氏水肿综合征进行排除性诊断，可有效检出巴氏水肿的患胎，但对 α 中间型的胎儿不具有诊断意义。Ge 等[38]选择致病区域位点的基因拷贝数变异（copy number variations，CNV）进行分析，通过探针靶向捕获 HBA 和HBB 上少于 1.5 Mb 的区域，运用二代测序，通过相对拷贝值（relative copy ratio，RCR）将高风险夫妇的母亲的血浆样本与正常样本进行对比，成功将携带纯合东南亚型缺失的 α 地贫胎儿排除。总的来说，α 地中海贫血的诊断策略更倾向于采用排除性诊断，但基于 SNP 和 STR 的方法在临床的应用缺乏普适性，推广较难；而运用分析 CNV 的方法对样本中胎儿 DNA 浓度的要求较高，其稳定性也有待提高。

3 β 地中海贫血的无创产前诊断技术

3.1 排除父源性突变遗传的诊断技术

2002 年，Chiu 团队[39]对携带 CD41/42（-CTTT）突变的父亲设计等位基因特异性引物和荧光探针，通过对荧光信号的检测排除携带父源性突变位点的胎儿。Li 等[40]运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术对高风险夫妇的胎儿进行父源性突变排除，检测结果达到了 100% 敏感度和 92.1% 特异度。该系统精确度高，可检测样本量大，但花费昂贵。该策略也存在局限性，其一，不能对患胎进行地贫基因的分型；其二，仅能排除胎儿是否携带父源性突变；最后，需要侵入性检查才能明确诊断。

临床上很多情况下高风险夫妻双方携带相同的突变，因此许多方法不能达到排除性诊断的目的。与排除突变基因相比，新一代遗传标记 SNP 通过对 SNP 位点的连锁分析，明确区分父母源性的等位基因，有效地达到排除性诊断的目的。随着芯片技术的发展，Papasavva 等[41-42]运用基于寡核苷酸芯片的阵列引物延伸（arrayed primer extension，APEX）方法，通过筛选 β 球蛋白相关的 SNP 位点，将 β 地中海贫血的无创诊断应用于塞浦路斯人群。在我国，Chan 的团队[43-44]采用结合等位基因特异性阵列引物延伸（allele-specific arrayed primer extension，AS-APEX）方法开发了“Thalassemia”微阵列，对 20 个 β 地贫高风险孕妇进行筛查，患胎检出率达 80%。Phylipsen 等[45]将焦磷酸解激活聚合反应（pyrophosphorolysis-activated polymerization，PAP）与高分辨熔解曲线分析（high resolution melting，HRM）技术相结合，在大于 97% 的背景 DNA 中检出小于 3%的目标 DNA，但该方法的应用需要先证者或其他家庭成员才能确定父源性突变的连锁 SNPs。2015 年，Xiong 等[46]通过长引物 PCR 对我国几种常见 β 地贫突变位点进行捕获，再通过二代测序排除父源性突变，灵敏度达 100%。该方法的局限性在于，需要建立有效的连锁 SNPs 位点数据库，部分家庭因缺失相应 SNP 位点而造成检测成功率下降，导致在临床上的应用受到限制。

与此同时，科研人员也致力于采用不同的分子策略，力求在传统检测方法上得到更高的灵敏度，其中之一就是提高胎儿游离 DNA 的富集程度。Ramezanzadeh 等[47]通过对凝胶电泳后的小于 300 bp 的目的片段分别进行手工提取和商业试剂盒提取 DNA，对父源性排除的诊断准确率均达100%。该方法容易对样品产生污染，对实验者操作要求较高。Galbiati 等[48]设计相应突变位点的肽核酸（peptide nucleic acids，PNA）间接富集 cffDNA，达到封闭母源性DNA 模板的效果，结合芯片对地中海人群携带的常见7 种突变进行检测并成功诊断胎儿是否携带父源性的遗传位点。但该技术需要对特异性突变位点进行优化，且不能用于夫妻携带同种突变的情况，这也限制了其常规大规模使用。随后 Galbiati 的团队[49-50]运用较低变性温度复合扩增PCR（co-amplification at lower denaturation temperature PCR，COLD-PCR）成功对多个常见 β 地中海贫血突变位点进行父源性遗传筛查。此方法通过在 PCR 过程中突变位点的变性温度差异进行富集，操作简单，实验流程较快，虽然该技术需要对不同突变位点的变性温度逐一摸索，但是能够有效提升灵敏度。2015 年，Liu 等[51]将引物引入限制性内切酶分析-聚合酶链反应（primer-introduced restriction analysis-polymerase chain reaction，PIRA-PCR）法应用于 β地贫的无创产前诊断中，该团队运用限制性消化酶选择消化野生型等位基因，间接达到母亲血浆中检测父源性突变等位基因的目的，但酶切位点不一定适用于每一种突变类型，这极大限制了在临床上的应用与推广。

3.2 母源性突变遗传的诊断技术

对母源性遗传位点的检测有利于 β 地中海贫血的无创产前诊断迈向临床，令孕妇真正免于有创检查。2010 年，Lo 等[52]通过对多个 SNP 位点进行捕获，然后筛选杂合性的 SNP 位点，运用单倍型相对剂量（relative haplotype dosage，RHDO）分析结合序贯概率比试验（sequential probability ratio test，SPRT）构建单倍型，成功对该家庭胎儿的基因型作出诊断。在该方法中筛选母亲为杂合子（A/B）和父亲为纯合子（A/A）的 SNPs，通过靶向测序对母亲血浆中的 SNPs 定位，对每个等位基因上相应位点的读长进行计数。首先采用 SPRT 对单倍型 I（携带突变位点的等位基因）或单倍型 II（携带野生位点的等位基因）进行观察，然后计算每个筛选后的 SNPs 在同一单倍型的叠加，接着计算判断胎儿的单倍型归属，最后对胎儿的基因型判断。随后，Lam 等[53]首先通过探针捕获包含 HBB 基因簇的 288 kb 区域，通过 dPCR（digital PCR）的方法在无家系分析的情况下确定父亲的单倍型，结合 RHDO 和 SPRT再确定母亲的单倍型，该方法成功对两个 β 地中海贫血家系胎儿的基因型进行准确判断。前者方法存在的明显局限性在于构建父母单倍型时，需要利用外祖父母及祖父母或先证者的遗传信息，采样难度大，可行性低，适用人群少；而后者克服这一难点，但在实验中需定制针对疾病的芯片，令实验周期更长，成本更高。

2016 年，Hui 等[54]利用 10X Genomics 的 Linked Read 技术及 Illumina 的测序技术，对父母双方单倍型分型，并成功应用母亲外周血分析胎儿是否遗传 β 地中海贫血在内的多种单基因病。该技术首先将大片段 DNA 与含有标签的凝胶珠子分布在同一个油滴中，每个油滴几乎只有一个大片段 DNA，这样每个油滴就形成一个小文库，最后通过加热令凝胶溶解，解除油滴封闭，混合产物在 Illumina测序平台上测序。通过该方法可以得到跨度在 30～100 kb的 Linked Read 信息，再根据这些信息进行单倍型分型。成功构建单倍型后，分别采用 Kolmogorov-Smirnov 检验和RHDO 分析推断胎儿是否遗传父亲和（或）母亲的致病位点。该方法的优势在于通过 Linked Read 的测序结果直接构建单倍型，无需通过先证者提供额外的遗传信息和复杂的计算，这不仅减少检测费用，而且扩大了高风险孕妇的适用范围。此外，还避免采用独特方法检测特殊突变位点。但是仍然无法克服第二代测序的缺点，如：对高 GC 和高重复区域无法扩增，导致不能提供足够的 SNPs 位点构建单倍型。

总的来说，建立父母及胎儿单倍型的检测策略成为 β地贫无创产前诊断的主要思路，该策略是基于 SNP 位点的分析建立，不同人群的有效位点位置不一、数量不同，仍需大量基础研究筛选足够多的有效 SNP 位点以及适用于不同家系的特异性 SNP 位点；cffDNA 含量较低而导致扩增效率差，以及扩增过程出现的偏差也是一个急需解决的问题；定制芯片的应用虽然令捕获程度更高，但使成本升高、实验周期增加。

4 未来技术展望

由于设备昂贵、操作繁琐、捕获效率低、扩增效率低及扩增偏差等问题，地中海贫血的无创产前诊断目前仍处于研发阶段。2015 年，由 Lv 等[55]提出的“循环单分子扩增和重测序技术（circulating single molecule amplification and re-sequencing technology，cSMART）”有望解决这些难题，其将目标区域 DNA 进行标记、环化、扩增，再通过高通量测序，实现对突变等位基因的百分率进行定性及绝对定量检测，更准确推断胎儿基因型，该方法在肝豆状核变性家系中得以验证；2016 年，Song 等[56]运用 cSMART 方法筛选有效 SNP 位点，成功对 Y 染色体上的 76-SNPs 进行了检测，基于该策略，在理论上可应用于地中海贫血的无创诊断。近期出现以单分子实时测序和纳米孔单分子测序为主的第三代测序平台，它们拥有高速度、高精度、免扩增、高通量、长读长等优势[57-58]。Guo 等[59]运用单分子实时测序技术对目标片段的连锁 SNPs 进行精确定位分析，这方法令单倍型的建立更加直接、简便，不需利用高风险夫妇家庭成员的遗传信息，使计算方法简化；2016 年，Shi 等[60]成功运用长读长测序组装中国人基因组“HX1”，为后续研究奠定基础。第三代测序平台可以凭借其长读长优势，获取更多具有信息的 SNPs，可以准确构建父母基因组的单倍型，推断胎儿基因型。相信在未来几年内，通过优化原有技术或者应用新的方法，必然使地中海贫血的无创产前诊断应用于临床。

[1]Higgs DR,Engel JD,Stamatoyannopoulos G.Thalassaemia.Lancet,2012,379(9813):373-383.

[2]Yin A,Li B,Luo M,et al.The prevalence and molecular spectrum ofα-and β-globin gene mutations in 14,332 families of Guangdong Province,China.PLoS One,2014,9(2):e89855.

[3]Cao A,Kan YW.The prevention of thalassemia.Cold Spring Harb Perspect Med,2013,3(2):a011775.

[4]Chui DH.Alpha-thalassemia:Hb H disease and Hb Barts hydrops fetalis.Ann N Y Acad Sci,2005,1054:25-32.

[5]Galanello R,Origa R.Beta-thalassemia.Orphanet J Rare Dis,2010,5:11.

[6]Mujezinovic F,Alfirevic Z.Procedure-related complications of amniocentesis and chorionic villous sampling:a systematic review.Obstet Gynecol,2007,110(3):687-694.

[7]Walknowska J,Conte FA,Grumbach MM.Practical and theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer.Lancet,1969,1(7606):1119-1122.

[8]Lo YM,Corbetta N,Chamberlain PF,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum.Lancet,1997,350(9076):485-487.

[9]Li Y,Zimmermann B,Rusterholz C,et al.Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms.Clin Chem,2004,50(6):1002-1011.

[10]Chan KC,Zhang J,Hui AB,et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma.Clin Chem,2004,50(1):88-92.

[11]Lo YM,Tein MS,Lau TK,et al.Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum:implications for noninvasive prenatal diagnosis.Am J Hum Genet,1998,62(4):768-775.

[12]Kinnings SL,Geis JA,Almasri E,et al.Factors affecting levels of circulating cell-free fetal DNA in maternal plasma and their implications for noninvasive prenatal testing.Prenat Diagn,2015,35(8):816-822.

[13]Lo YM,Zhang J,Leung TN,et al.Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma.Am J Hum Genet,1999,64(1):218-224.

[14]Bianchi DW,Williams JM,Sullivan LM,et al.PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploid pregnancies.Am J Hum Genet,1997,61(4):822-829.

[15]Hung EC,Chiu RW,Lo YM.Detection of circulating fetal nucleic acids:a review of methods and applications.Clin Pathol,2009,62(4):308-313.

[16]Costa JM,Benachi A,Gautier E.New strategy for prenatal diagnosis of X-linked disorders.N Engl J Med,2002,346(19):1502.

[17]Faas BH,Beuling EA,Christiaens GC,et al.Detection of fetal RHD-specific sequences in maternal plasma.Lancet,1998,352(9135):1196.

[18]Lo YM,Hjelm NM,Fidler C,et al.Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma.N Engl J Med,1998,339(24):1734-1738.

[19]Fan HC,Gu W,Wang J,et al.Non-invasive prenatal measurement of the fetal genome.Nature,2012,487(7407):320-324.

[20]Van der Schoot CE,Soussan AA,Koelewijn J,et al.Non-invasive antenatal RHD typing.Transfus Clin Biol,2006,13(1-2):53-57.

[21]Amicucci P,Gennarelli M,Novelli G,et al.Prenatal diagnosis of myotonic dystrophy using fetal DNA obtained from maternal plasma.Clin Chem,2000,46(2):301-302.

[22]Meaney C,Norbury G.Noninvasive prenatal diagnosis of early onset primary dystonia I in maternal plasma.Prenat Diagn,2009,29(13):1218-1221.

[23]González-González MC,Trujillo MJ,Rodríguez de Alba M,et al.Huntington disease-unaffected fetus diagnosed from maternal plasma using QF-PCR.Prenat Diagn,2003,23(3):232-234.

[24]González-González MC,Garcia-Hoyos M,Trujillo-Tiebas MJ,et al.Improvement in strategies for the non-invasive prenatal diagnosis of Huntington disease.J Assist Reprod Genet,2008,25(9-10):477-481.

[25]Chitty LS,Griffin DR,Meaney C,et al.New aids for the non-invasive prenatal diagnosis of achondroplasia:dysmorphic features,charts of fetal size and molecular confirmation using cell-free fetal DNA in maternal plasma.Ultrasound Obstet Gynecol,2011,37(3):283-289.

[26]Chiu RW,Lau TK,Cheung PT,et al.Noninvasive prenatal exclusion of congenital adrenal hyperplasia by maternal plasma analysis:a feasibility study.Clin Chem,2002,48(5):778-780.

[27]González-González MC,García-Hoyos M,Trujillo MJ,et al.Prenatal detection of a cystic fibrosis mutation in fetal DNA from maternal plasma.Prenat Diagn,2002,22(10):946-948.

[28]Bustamante-Aragones A,Gallego-Merlo J,Trujillo-Tiebas MJ,et al.New strategy for the prenatal detection/exclusion of paternal cystic fibrosis mutations in maternal plasma.J Cyst Fibros,2008,7(6):505-510.

[29]Chiu RW,Chan KC,Gao Y,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma.Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(51):20458-20463.

[30]Gil MM,Quezada MS,Revello R,et al.Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies:updated meta-analysis.Ultrasound Obstet Gynecol,2015,45(3):249-266.

[31]Norton ME,Wapner RJ.Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy.N Engl J Med,2015,373(26):2582.

[32]Tungwiwat W,Fucharoen S,Fucharoen G,et al.Development and application of a real-time quantitative PCR for prenatal detection of fetal alpha(0)-thalassemia from maternal plasma.Ann N Y Acad Sci,2006,1075:103-107.

[33]Pornprasert S,Sukunthamala K,Kunyanone N,et al.Analysis of real-time PCR cycle threshold of alpha-thalassemia-1 Southeast Asian type deletion using fetal cell-free DNA in maternal plasma for noninvasive prenatal diagnosis of Bart's hydrops fetalis.J Med Assoc Thai,2010,93(11):1243-1248.

[34]Pornprasert S,Sukunthamala K,Kunyanone N,et al.Semi-nested Taqman real-time quantitative PCR for noninvasive prenatal diagnosis of Bart's hydrops fetalis.J Med Assoc Thai,2012,95(1):6-9.

[35]Sirichotiyakul S,Charoenkwan P,Sanguansermsri T.Prenatal diagnosis of homozygous alpha-thalassemia-1 by cell-free fetal DNA in maternal plasma.Prenat Diagn,2012,32(1):45-49.

[36]Ho SS,Chong SS,Koay ES,et al.Noninvasive prenatal exclusion of haemoglobin Bart's using foetal DNA from maternal plasma.Prenat Diagn,2010,30(1):65-73.

[37]Yan TZ,Mo QH,Cai R,et al.Reliable detection of paternal SNPs within deletion breakpoints for non-invasive prenatal exclusion of homozygous α-thalassemia in maternal plasma.PLoS One,2011,6(9):e24779.

[38]Ge H,Huang X,Li X,et al.Noninvasive prenatal detection for pathogenic CNVs:the application in α-thalassemia.PLoS One,2013,8(6):e67464.

[39]Chiu RW,Lau TK,Leung TN,et al.Prenatal exclusion of beta thalassaemia major by examination of maternal plasma.Lancet,2002,360(9338):998-1000.

[40]Li Y,Wenzel F,Holzgreve W,et al.Genotyping fetal paternally inherited SNPs by MALDI-TOF MS using cell-free fetal DNA in maternal plasma:influence of size fractionation.Electrophoresis,2006,27(19):3889-3896.

[41]Papasavva T,Kalakoutis G,Kalikas I,et al.Noninvasive prenatal diagnostic assay for the detection of beta-thalassemia.Ann N Y Acad Sci,2006,1075:148-153.

[42]Papasavva T,Kalikas I,Kyrri A,et al.Arrayed primer extension for the noninvasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia based on detection of single nucleotide polymorphisms.Ann N Y Acad Sci,2008,1137:302-308.

[43]Chan K,Wong MS,Chan TK,et al.A thalassaemia array for Southeast Asia.Br J Haematol,2004,124(2):232-239.

[44]Chan K,Yam I,Leung KY,et al.Detection of paternal alleles in maternal plasma for non-invasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia:a feasibility study in southern Chinese.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2010,50(1):28-33.

[45]Phylipsen M,Yamsri S,Treffers EE,et al.Non-invasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia and sickle-cell disease using pyrophosphorolysis-activated polymerization and melting curve analysis.Prenat Diagn,2012,32(6):578-587.

[46]Xiong L,Barrett AN,Hua R,et al.Non-invasive prenatal diagnostic testing for β-thalassaemia using cell-free fetal DNA and next generation sequencing.Prenat Diagn,2015,35(3):258-265.

[47]Ramezanzadeh M,Salehi M,Farajzadegan Z,et al.Detection of paternally inherited fetal point mutations for β-thalassemia in maternal plasma using simple fetal DNA enrichment protocol with or without whole genome amplification:an accuracy assessment.J Matern Fetal Neonatal Med,2016,29(16):2645-2649.

[48]Galbiati S,Foglieni B,Travi M,et al.Peptide-nucleic acid-mediated enriched polymerase chain reaction as a key point for non-invasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia.Haematologica,2008,93(4):610-614.

[49]Galbiati S,Brisci A,Lalatta F,et al.Full COLD-PCR protocol for noninvasive prenatal diagnosis of genetic diseases.Clin Chem,2011,57(1):136-138.

[50]Galbiati S,Monguzzi A,Damin F,et al.COLD-PCR and microarray:two independent highly sensitive approaches allowing the identification of fetal paternally inherited mutations in maternal plasma.J Med Genet,2016,53(7):481-487.

[51]Liu S,Chen L,Zhang X,et al.Primer-introduced restriction analysis polymerase chain reaction method for non-invasive prenatal testing of β-thalassemia.Hemoglobin,2015,39(1):18-23.

[52]Lo YM,Chan KC,Sun H,et al.Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus.Sci Transl Med,2010,2(61):61ra91.

[53]Lam KW,Jiang P,Liao GJ,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by targeted massively parallel sequencing of maternal plasma:application to β-thalassemia.Clin Chem,2012,58(10):1467-1475.

[54]Hui WW,Jiang P,Tong YK,et al.Universal haplotype-based noninvasive prenatal testing for single gene diseases.Clin Chem,2017,63(2):513-524.

[55]Lv W,Wei X,Guo R,et al.Noninvasive prenatal testing for Wilson disease by use of circulating single-molecule amplification and resequencing technology (cSMART).Clin Chem,2015,61(1):172-181.

[56]Song Y,Zhou X,Huang S,et al.Quantitation of fetal DNA fraction in maternal plasma using circulating single molecule amplification and re-sequencing technology (cSMART).Clin Chim Acta,2016,456:151-156.

[57]Branton D,Deamer DW,Marziali A,et al.The potential and challenges of nanopore sequencing.Nat Biotechnol,2008,26(10):1146-1153.

[58]Roberts RJ,Carneiro MO,Schatz MC.The advantages of SMRT sequencing.Genome Biol,2013,14(7):405.

[59]Guo X,Lehner K,O'Connell K,et al.SMRT sequencing for parallel analysis of multiple targets and accurate SNP phasing.G3 (Bethesda),2015,5(12):2801-2808.

[60]Shi L,Guo Y,Dong C,et al.Long-read sequencing and de novo assembly of a Chinese genome.Nat Commun,2016,7:12065.

广州市科技和信息化局重点项目（201508020258、201400000003-4、201400000004-4）

510150 广州，广东省产科重大疾病重点实验室/广东省普通高校生殖与遗传重点实验室/广州医科大学附属第三医院妇产科研究所

孙筱放，Email：xiaofangsun@gzhmu.edu.cn

2017-01-01

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.012