我国甘蔗属割手密种质资源收集与研究概况

吴凯朝，邓智年，魏源文，徐林，曹辉庆，罗海斌，黄诚梅*，蒋胜理

（1.广西农业科学院甘蔗研究所/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁530007；2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁530007）

我国甘蔗属割手密种质资源收集与研究概况

吴凯朝1，邓智年1，魏源文2，徐林1，曹辉庆2，罗海斌2，黄诚梅2*，蒋胜理2

（1.广西农业科学院甘蔗研究所/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁530007；2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁530007）

对我国割手密的调查和收集、遗传多样性、种质鉴定评价、种质创新和基因开发利用等多个前沿方向的研究概况进行了系统性综述，同时展望了割手密在甘蔗育种中的应用前景。

甘蔗；割手密；育种；种质资源

割手密（Saccharum spontaneum L.）具有抗逆能力强、宿根性能好、生长势旺盛、地域适应性广等优良特性，是拓宽甘蔗抗逆育种遗传基础的重要资源。它不仅是最早被应用于甘蔗育种和最有价值的甘蔗属近缘野生种质[1]，也是具有高含糖量且基因类型最丰富的甘蔗属近缘野生种质[2]。随着我国甘蔗育种对甘蔗属和近缘属野生种质血缘的利用日益重视，越来越多关于割手密的研究见于报道。本研究旨在从我国割手密的调查和收集、遗传多样性、种质鉴定评价、种质创新和基因开发利用等多个前沿方向进行详述。

1 调查与收集

割手密（别名甜根子草）是颖花目禾本科蜀黍族甘蔗属多年生草本植物，直立茎或匍匐茎，茎细长，高（长）度0.4～6 m。茎基部稍斜，节间细纺锤形，蜡粉带厚，叶片细长而坚硬，中脉特别发达，叶鞘秃净，少数有51、56毛群，芽三角形，白色圆锥花序20～40cm，小穗卵状矩圆形[1]。割手密繁殖方式为有性繁殖和无性繁殖，种内变异丰富，主要生长在江边、河边、溪边、沟边、水库边、池塘边、沼泽、田埂等湿地上，在干旱的坡地甚至沙漠、海边盐碱地和高海拔喜马拉雅山地区也有分布[3]，但植株相对矮小。割手密生长势极旺盛，宿根性好，抗逆性强，根系异常发达，耐旱、耐瘠、耐涝，对环境有极强的适应能力，在没有受人类生产活动破坏的自然生态区，割手密多数连片生长，对保持水土流失起到重要的作用。割手密在我国分布范围广（北纬18°15'～33° 20'N，东经97°～122°E，海拔1～2700 m），遍及多个气候区，是甘蔗属中地理分布最广、类型最丰富的种群。从上世纪70年代开始，广西、云南、广东、四川、福建等省（区）的甘蔗育种机构都十分重视对野生割手密种质资源的调查和收集研究工作[4-6]，并建立了各省甘蔗野生种质资源保育圃，在云南还建立了国家甘蔗野生种质资源圃，对我国甘蔗野生种质资源的保护和利用做出了重大的贡献。

2 遗传多样性与种质鉴定、评价

2.1 遗传多样性

2.1.1 形态学标记多样性我国割手密分布范围广泛，无性系在不同的地理生态条件下形态各异，通过形态学分类是最有效的方法之一。各位学者主要通过株高、茎径、单茎重、节间长度、节数、叶长、叶宽、萌芽率、分蘖率、锤度、蔗汁糖分、纤维分、生育期、生物产量、光合特性等多个性状对我国割手密资源进行分类[5，7-15]，表明我国割手密种类多样性极为丰富，筛选出割手密初级核心种质[16]，为割手密亲本的选择利用提供参考。

2.1.2 细胞学标记多样性割手密染色体数目变化范围较大（2n=40～128），我国已发现有2n=60、2n=64、2n= 70、2n=72、2n=76、2n=78、2n=80、2n=84、2n=88、2n=92、2n=96、2n=102、2n=104、2n=108等不同染色体数目类型的割手密[17-21]。林日坚等[22]的研究表明，拔地拉和高大型崖城割手密的染色体数目均是2n=80，拔地拉和崖城割手密的Gicmsa深浅染色区有很大差别，显示了种间的特异性。王英等[23]采用核型分析方法对崖城割手密11号和拔地拉进行研究发现，崖城割手密11号染色体数目为2n=64，核型类型为2A型，而拔地拉染色体数目为2n=80，核型类型为1B型，它们核型在进化上都属于较原始类型，但崖城割手密11号要比拔地拉更为原始。王先宏等[24]分析10份不同基因型的割手密材料，2份为1B核型、7份为2B核型、1份为2C核型，参试材料间的核型均存在差异且不对称。王平等[25]应用荧光原位杂交技术在云南82-114（2n=80，10倍体）和福建89-1-19（2n=104，13倍体）染色体上进行5S rDNA定位研究，发现云南82-114中有10个信号位点定位在着丝粒附近，而在福建89-1-19中13个信号位点多数定位靠近着丝粒，少数在着丝粒附近的长臂上。5S rDNA位点数与割手密材料倍性具有相关性，在染色体上没有固定的分布模式，5S rDNA在不同染色体上的拷贝数存在较大的差异，揭示了割手密染色体结构多样性和5S rDNA拷贝数多样性，可在分子水平上为染色体提供有效的识别标记，有助于物种的进化及亲缘关系的分析。

2.1.3 生化标记多样性在割手密研究中，主要以过氧化物酶和酯酶的同工酶谱进行分析为主，已被应用于鉴别不同种、属间的亲缘关系、地理分布和起源、品种群分类以及鉴别遗传变异等诸方面的研究工作。林炎坤等[26]对50份广西割手密材料过氧化物酶同工酶进行分析，把50份割手密分为12个类群，来源于桂东北和桂东地区的多数材料，属于谱型简单即酶带数目少的类群，桂南和桂西南的材料，酶带数目较多，较为复杂，该结果与割手密的染色体数目具有的地理分布特点相似，即低纬度地区的割手密染色体数目比高纬度地区割手密的染色体数目多[26]。潘世明等[5，27－29]研究表明割手密同工酶谱与海拔高度密切相关，并指出割手密有从低海拔地区向高海拔地区发展的趋势。成萍和陈西凯[30-31]的研究结果得出过氧化物酶可作为割手密种群划分的生化指标，过氧化物酶酶谱反映了遗传多样性和地理分布特点，并推断川东南地区尤其是长江、嘉陵江河谷地带可能是四川割手密分布的中心地带之一。陈能武等[2]对79份四川割手密的酯酶同工酶谱进行分析，发现10条酶带组成18种酶谱类型，表明四川割手密类型多样性丰富。酯谱分析还发现酶带有无与材料来源相关，酶带迁移率与材料的开花迟早、锤度和株叶形等性状密切相关。

2.1.4 DNA分子标记多样性DNA分子标记不受植物发育阶段和环境因子影响，多数标记为共显性，能够鉴别纯合基因与杂合基因型。特别是SSR等分子标记能与目的基因紧密连锁，能通过分子标记对目标性状进行筛选，因而很大程度降低育种的盲目性，加快育种进程。樊丽娜等[32]采用Genomic-SSR引物和EST-SSR引物对广东67份割手密材料进行分析，结果表明两种类型SSR获得的各个材料间的遗传关系具有较高的一致性，广东割手密之间的遗传关系和地理来源存在一定的相关，由南向北存在较为显著的地理分化。刘洪博等[33]利用SSR引物对新收集的云南省11份割手密材料和14份国家资源圃代表性材料进行遗传多样性分析，结果表明新采集材料的多态性条带为207条，其中14条为特有条带，11份新材料在相似性系数0.64点可划分为3个类群，具有丰富的遗传多样性，与国家资源圃材料相比具有一定的差异性，说明在云南海拔高度落差变化大的特有地理条件下，分布着丰富的遗传差异显著的割手密无性系。徐磊等[34]选用高粱Genomic-SSR引物和EST-SSR引物在割手密种质GSM39中进行引物筛选，70%的EST-SSR引物在割手密中得到成功扩增，14对EST-SSR多态性引物在14份割手密中共检测到等位基因33个，等位基因平均为2.4个，有效等位基因平均为1.7个，这对割手密遗传多样性研究和比较基因组学研究具有重要意义。DNA分子标记相关技术研究也取得一定的进展，如对割手密叶绿体DNA[35]和线粒体DNA[36]的提取、AFLP[37-38]、SSR[39-40]、ISSR[41]和SCoT[42]等分子标记体系建立，为割手密指纹图谱绘制、种质鉴定、遗传多样性、基因定位提供了技术支持。

2.2 种质鉴定、评价

2.2.1 抗寒性割手密是拓宽甘蔗抗寒育种遗传基础的重要资源。目前，我国对割手密抗寒性能力鉴定、综合评价研究较少。戴献英[43]用电解质渗漏法对50个云南割手密无性系进行抗寒能力鉴定，结果表明割手密的电解质渗漏率随海拔高度的上升而下降，随纬度增高而降低，高海拔、高纬度的割手密抗寒能力强，低海拔、低纬度的割手密抗寒能力差，这种抗寒能力差异可能是割手密长期在不同生长地域生态适应性的结果。丁灿等[44-45]研究低温对割手密和斑茅游离脯氨酸含量的影响，发现割手密叶片中游离脯氨酸含量与割手密无性系来原地海拔、纬度呈极显著正相关，叶片中游离脯氨酸含量与割手密抗寒性也密切相关，因此叶片中游离脯氨酸含量可作为甘蔗近缘野生种抗寒能力鉴定指标。蔡泽林[46]的研究结果表明割手密的多项抗旱生理指标表现都优于斑茅、河八王和芒，还提出对西藏、新疆等地区野生割手密种质资源进行收集。陈能武等[2]对四川的割手密材料进行抗寒性研究，筛选出川88-33、川79-l-4、川79-1-23以及内江44等耐寒能力极稳定的材料，这些优异种质新材料是今后甘蔗抗寒育种的宝贵亲本材料。

2.2.2 抗旱性甘蔗杂交亲本具有的抗旱优良基因是甘蔗抗旱育种成败的关键。因此，重视对甘蔗野生种质资源亲本的抗旱性综合评价，为甘蔗杂交育种优良抗旱亲本选择利用有重要的参考价值。许文花等[47]通过9个生理指标研究水分胁迫对割手密伸长期的影响，结果显示割手密无性系间各指标的耐旱系数有差异，表明割手密无性系间的抗旱能力不同，提出单一指标很难准确地反映割手密无性系的抗旱能力，需结合多个指标进行综合性评价。姚艳丽等[48]研究干旱胁迫下甘蔗、割手密和斑茅SOD、POD和CAT酶活性的变化，结果显示割手密SOD、POD和CAT的酶活性随着干旱胁迫时间的延长呈上升趋势，斑茅的SOD和POD活性整体也表现为上升趋势，随着干旱胁迫时间的延长，甘蔗品种ROC22的SOD表现为先降后升的变化趋势，POD和CAT均表现为下降的变化趋势，综合分析表明割手密和斑茅的抗旱能力强于ROC22。经艳芬等[49]对云南割手密及其血缘的F1代抗旱能力进行鉴定研究，结果表明15个F1代种质材料80%表现出强抗旱性，获得云割F108-319等7个抗旱性优良材料，而8个割手密无性系抗旱性表现有强有弱，抗旱性强的材料占37.5%，抗旱性与来源地无相关性。割手密抗旱性是一个复杂的特性，在育种进程中需要不断进行鉴定评价，以更有效提高抗旱育种效率。桃联安等[50]通过对12份西双版纳割手密82-114血缘F2代材料进行抗旱能力综合评价，结果表明抗旱性较强材料5份，抗旱性中等材料3份，抗旱性较弱材料4份，但12份材料的抗寒性均强于ROC22。边芯等[51]对云南割手密血缘F1材料及亲本共28份材料进行抗旱能力综合评价，发现叶绿素因子、地下干物质积累因子和地上干物质积累因子等前6个主成分因子累计贡献率达90.11%，获得强抗旱性材料2份（云割F108-317和云割F108-319），以及可在育种实践中优先利用的创新种质材料5份（云割F108-392、云割F108-391、云割F108-511、云割F108-397和云割F108-617）。李旭娟等[52-53]以甘蔗亲本材料和甘蔗原种作为对照，选用5对抗旱、耐高温功能标记（DREB、AQP、HSP70、WRKY1）随机引物对我国22份八倍体和50份十倍体割手密无性系进行遗传多样性分析，结果表明十倍体割手密无性系在抗旱标记和耐高温标记上都与甘蔗亲本、甘蔗原种有较大的遗传差异，而且抗旱标记比耐高温标记的遗传变异要丰富。八倍体、十倍体割手密资源中很多优良的抗逆遗传基础尚未渗入到现代商业品种，因此在后续甘蔗新品种抗逆性状改良和亲本创新上应进一步加大对八倍体、十倍体割手密资源的发掘和利用。上述这些通过生理生化和数量统计分析相结合综合评价具有抗旱遗传优势的割手密材料，可为甘蔗抗旱育种直接利用。

2.2.3 抗病性杨李和[54]对云南割手密种、斑茅、滇蔗茅血缘后代45份材料进行抗黑穗病鉴定，获得1级高抗病材料27份，2级抗病材料3份，占67%，而对照ROC10和桂糖11分别表现为感病6级、7级，表明野生种质血缘是高抗黑穗病遗传基础，是选育高抗黑穗病甘蔗新品种的前提。在27份1级高抗材料中，11份属于自交系后代，表明“异质复合分离理论”假说的“自交超亲分离”技术，能够有效地选育出高抗黑穗病的超亲遗传变异亲本，其后代抗病性杂种优势突出。

2.2.4 抗辐射云南农业大学采用增强紫外线UV-B辐射强度对割手密无性系敏感性进行评价研究，通过研究模拟紫外辐射增强对割手密无性系形态（株高和茎径）、生理（叶绿素含量、成熟期锤度、丙二醛含量）、土壤微生物种群数量、根际真菌数量和优势种群、叶片附生真菌数量和优势种群等多个方面的影响[55-63]，筛选出耐性材料（90-15）和敏感型材料（II91-93）。

3 基因挖掘

割手密是甘蔗育种中重要的野生血缘供体亲本和抗逆性状基因基础。随着分子生物学技术的迅猛发展，从割手密中直接挖掘优异基因并通过转基因手段改良甘蔗栽培品种成为新的途径。刘洪博等[64]采用高通量转录组测序分析干旱胁迫24、48和72 h的云南割手密82-114的根系，与CK相比分别获得显著上调差异表达基因3061、2304和3236个，主要参与转录激活、水分运输、DNA结合、ATP结合及细胞膜、跨膜运输和防御反应等有关代谢活动。KEGG富集结果显示，干旱胁迫24 h的样本有2248个差异表达基因参与了107条代谢途径，干旱胁迫48 h的样本有2114个差异表达基因参与了130条代谢途径，干旱胁迫72 h的样本有2392个差异表达基因参与了144条代谢途径，筛选到鞘糖脂生物合成途径、MAP激酶信号途径和ABC转运蛋白等与非生物胁迫或逆境相关，共获得稳定上调表达基因70个，如细胞外信号调节激酶、磷脂酶D、β-氨基己糖苷酶和ATP结合盒B亚族（MDR/TAP）等。侯平等[65]采用基因芯片技术筛选出甘蔗热带种和割手密种间的差异表达基因1245个，Solexa技术筛选出甘蔗热带种和割手密种间差异表达基因1432个，两种技术获得823个相同差异基因，基因功能主要涉及非生物刺激响应、磷代谢、转录调控等方面。目前，通过克隆的方法已在割手密中分离出Prxs基因[66]、2个POD等位基因序列（SsPOD-1a和SsPOD-1b）[67]、铜锌超氧化物歧化酶基因（SsSOD-1a）[68]、4个割手密DREB2基因序列（SsDREB2-a、SsDREB2-f、SsDREB2-1、SsDREB2-2）[69-70]、GST基因（SsGST）[71]和2个割手密过氧化氢酶基因（SsCAT-1c、SsCAT-1d）[72]，这些优异基因的挖掘和功能鉴定，为开展甘蔗抗逆遗传改良研究奠定的基础。

4 种质创新

4.1 杂交种质材料

割手密能很好地把抗逆、对病害免疫能力等优良特性遗传给后代，所以割手密成了甘蔗育种中最重要的野生种质。早期提出了“割手密2、3代强化育种理论”来选育甘蔗良种，但事实上多数甘蔗品种含割手密血缘甚少[73]。现阶段，育种家通过多种途径进行割手密的种质创新，拟解决“高贵化”育种基因来源狭窄的问题。云南瑞丽育种站[74]提出“异质复合分离理论”，使用POJ3016作为母本与云南野生割手密种杂交，获得表现高糖性状超亲优势且含有较多的割手密血缘而表现出野生优良性状的杂种F193/2418，突破了割手密杂种F1必然低糖和必须经过多代回交（F4、F5）使染色体比例为6：1～9：1才能获得高糖性状的遗传规律。该方法为实现在回交低代（F2、F3）选育出高产、高糖、地域适应性广的突破性新材料，从理论方法到种质创新实践中找到新的突破口。同样用甘蔗传统亲本POJ、Co、ROC与云南野生种质进行远缘杂交，进一步验证了“异质复合分离理论”假说，于2001年起陆续提供YN系列杂交花穗[75]。广西甘蔗研究所通过对斑茅与割手密杂交、斑割复合体与甘蔗杂交的真杂种F1后代农艺特性、分子标记及细胞染色体数目及核型开展研究，发现后代多为偏父性遗传，确定了斑茅与割手密杂交、甘蔗品种（系）与斑割复合体杂交的染色体传递均为“n+n”方式，并获得一批真杂种材料[76-79]。朱建荣等[80]把云割F1、F2，崖城71-374（F2）及其后代与国内外常用亲本配成的30个杂交组合，并分析有性世代主要性状的遗传效应，筛选出7个可做父本的优良创新种质、亲本材料，5个高糖亲本材料，3个高产、高糖优良创新组合，7个高生物量能源甘蔗育种优良创新组合。吴才文等[81-82]利用Co419与云割75-1-2杂交和ROC25与远缘杂交后代云野02-356回交的后代F1和BC1真杂种研究杂种后代的产量、品质性状的遗传规律，发现杂交后代的产量、品质性状的广义遗传力高，F1株高、有效茎、蔗茎产量和宿根性表现出明显的超亲优势，BC1群体产量性状广义遗传力高于F1群体，F1含糖量和纤维含量高于商业亲本，BC1含糖量高于双亲。经艳芬等[83]通过8个农艺性状因子对70份云南割手密血缘F1创新种质进行综合评价，鉴定出35份为高产材料，50份为高糖材料，27份为高产、高糖材料。刘洪博等[84]使用SSR分子标记分析云南割手密（父本）与甘蔗（母本）杂交后代的遗传关系，结果显示140个F1材料中鉴定出109个真实杂种，27个是假杂种，4个自交系。真杂种的父性遗传的评估结果表明，父性遗传率相对较高。高轶静等[85]利用SRAP和SSR分子标记鉴定甘蔗与斑割复合体杂交后代真假杂种，两种分子标记鉴定结果相互印证，在3个杂交组合的后代中获得含斑茅血缘的34份真杂种。刘建乐等[86]对20份割手密无性系进行铝胁迫研究，筛选出耐铝毒基因型割手密A13、A20、A23，铝胁迫敏感基因型割手密A31、A24、A50。王水琦等[87]利用形态学、同工酶和RAPD、ISSR分子标记对果蔗与斑茅、割手密种间杂交后代进行鉴定，获得48号、49号真杂种，真杂种均表现出偏一亲本遗传特点，同时兼具另一亲本优良基因基础，可作为甘蔗育种的优良亲本。该研究还发现，引物S260和W835能一次性准确鉴定甘蔗杂种及其亲本。上述研究获得的创新种质为进一步利用割手密优异遗传基础改良甘蔗品种提供前提，拓宽了甘蔗育种遗传基础来源。

杂种后代综合评价方法对亲本高效筛选和杂交利用具有较明确的指导作用，为割手密筛选评价提供了新的方法。桃联安等[88-92]研究5种分析法对割手密与甘蔗杂交后代的鉴定选择效果，结果表明区分度最大的是DTOPSIS分析法，准确度最高的是同异分析法，共获得41份超过ROC22材料，60份超过粤糖93-159材料，22份超过对照ROC10材料，为甘蔗新品系的选育提供了优良的创新种质。

4.2 组织培养

上世纪80年代，组培技术被应用到割手密无性系增殖研究，但其初期研究主要的目的是为了获得丰富的变异无性系[93-95]。李富生等[96]对21个地理来源及株高、茎径、锤度等性状各异的割手密无性系进行组培研究，结果表明不同基因型割手密在愈伤组织的诱导、继代、分化培养中都表现出明显的差异，指出我国割手密具有丰富的种内变异。李松等[97]分别采用共培养法和基因枪法将陇川割手密DNA提取液转导到桂糖11的离体细胞内并分化成苗，共培养法和基因枪法获得的变异株系，在芽形、茎形、毛群等性状都有不同程度的变异，且基因枪法获得的变异株系的变异较明显。通过过氧化酶物同工酶谱分析证明，基因枪导入法获得的转导再生变异苗比供体缺少一条酶带，但未能证实陇川割手密的DNA是否已成功转导到桂糖11。吴凯朝等[98]从愈伤组织诱导、继代、分化、壮苗、生根等方面对割手密GX83-10的组培技术进行探讨，为进一步开展割手密抗逆优良基因功能鉴定研究提供技术支持。

5 应用前景

研究表明我国现有的商业品种中较少含有国内割手密血缘，一些品种含有的割手密血缘来源主要限于崖城割手密、陵水割手密和云南75-2-11[99]。因此，对我国割手密优异种质的开发和利用前景广阔。优异种质作为育种亲本，可进一步创新种质，解决我国甘蔗育种基因来源狭窄的难题。优异种质基因发掘，特别是抗旱、抗寒、抗病基因等优良基因资源，可为甘蔗品种分子遗传改良提供前提。

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Collection and Research Overview of Saccharum spontaneum L. Germplasm Resource in China

WU Kai-chao1,DENG Zhi-nian1,WEI Yuan-wen2,XU Lin1,CAO Hui-qing2,LUO Hai-bin2,et al
(1.Sugarcane Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement(Guangxi),China Ministry of Agriculture/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement,Nanning 530007; 2.Guangxi Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Biotechnology,Nanning 530007)

The research advances of Saccharum spontameum L.in China that included investigation and collection,genetic diversity,germplasm identification and evaluation,germplasm innovation and gene exploitation and utilization were systematically reviewed.Moreover,the application prospect of Saccharum spontameum L.in sugarcane breeding was prospected.

sugarcane;Saccharum spontaneum L.;breeding;germplasm resource

S566.103

B

1007－2624（2017）05－0045－06

10.13570/j.cnki.scc.2017.05.016

2017-05-05

国家自然科学基金项目（31400281）；广西自然科学基金项目（2014GXNSFAA118128）；广西农业科学院科技发展基金项目（2015JZ11）。

吴凯朝（1979-），副研究员，主要从事甘蔗分子遗传育种研究工作，E-mail：kaichaowu@126.com。

黄诚梅（1977-），女，广西上思人，副研究员，研究方向：甘蔗栽培与分子生物学，E-mail：huangchengmei@gxaas.net。