坏死性凋亡与中枢神经系统退行性疾病的研究进展

杨海玉 刘勇

坏死性凋亡与中枢神经系统退行性疾病的研究进展

杨海玉 刘勇

坏死性凋亡(necroptosis)是最新发现的一种程序性细胞坏死途径，在死亡受体信号激活后由受体交互作用蛋白1(RIP1)和RIP3调控，该途径并可被化合物5-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮(necrostatin-1)特异性抑制。目前研究表明坏死性凋亡可能参与了包括阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化等多种中枢神经系统退行性疾病的发生机制。深入阐明坏死性凋亡信号通路与神经退行性疾病发生之间的关系，有望为其治疗药物开发提供潜在的新靶点。基于此，本文对坏死性凋亡与中枢神经系统退行性疾病的相关性研究进行综述。

坏死性凋亡；神经退行性疾病；中枢神经系统

中枢神经系统退行性疾病是指一组以神经功能退行性改变为特征的疾病的总称，包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson disease，PD)和肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等，多呈慢性进行性病程，其病因和发病机制尚不明确，主要病理表现为具有特定功能的神经核团萎缩和神经元丢失。目前公认的细胞死亡类型有3种，包括坏死、凋亡和自噬。其中，凋亡和自噬均为细胞自我调控的主动过程，因此被称为“程序性死亡”，而坏死通常被认为是不可调控的过程。最近研究发现了一种新的可调控坏死方式，该坏死方式被命名为坏死性凋亡(necroptosis)。坏死性凋亡日益得到关注，该途径不同于传统的凋亡和坏死，但发生机制却与二者密切相关[1-3]。现有研究表明坏死性凋亡涉及多种中枢神经系统退行性疾病的发生机制，有望为治疗这些疾病的药物开发提供潜在新靶点[4-5]。因此，深入阐明坏死性凋亡信号通路与神经退行性疾病之间的关系具有一定的临床指导意义。

1 坏死性凋亡信号通路的分子调控机制

坏死性凋亡是指由死亡受体配基启动、通过死亡受体介导的在凋亡通路受到抑制的情况下发生的一类细胞坏死，该途径可被小分子化合物5-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮(necrostatin-1，Nec-1)特异性阻断。在形态学上，坏死性凋亡具有以下特点：(1)具有明显的坏死特征，其细胞形态改变与传统的细胞坏死相似，表现为细胞膜、溶酶体和线粒体崩解、线粒体膜电位丧失；(2)常伴随大量炎性细胞浸润；(3)常伴有自噬小体形成。研究表明受体交互作用蛋白(receptor interaction protein，RIP)，包括RIP1和RIP3在坏死性凋亡信号通路中起到关键作用，两者均属于丝/苏氨酸蛋白激酶[5]。RIP1由包括羧基端死亡决定簇(death domain，DD)、RIP家族相互作用序列(RIP family homotypic interaction motifs，RHM)和氨基端激酶结构域(kinase domain，KD)三部分构成。RIP3仅包括RHM和KD两部分。RIP1通过DD部分与活化的死亡受体结合，形成复合物Ⅰ。随后复合物Ⅰ经历受体介导的内吞作用，形成有被小泡进入细胞，当其与胞内体的小囊泡结合后，受体从其中解离出来进入再循环，而胞质中的RIP3通过RHM部分与RIP1结合，形成复合物Ⅱ。RIP1和RIP3结合后可通过其KD部分相互磷酸化，这是坏死性凋亡发生的关键步骤。现有研究证实RIP1和RIP3磷酸化导致其构型发生变化，从而促进复合物Ⅱ的稳定；而当RIP3发生磷酸化后即被活化，可将信号向下游传递[6-7]。RIP3活化后可在胞浆中进一步募集、活化其他蛋白，这一过程依赖于RIP3的激酶功能，其主要的功能是激活能量代谢相关酶。RIP3的作用蛋白包括如糖原磷酸化酶、谷氨酸氨基连接酶和谷氨酸脱氢酶1等，可使三羧酸循环和呼吸链(主要是呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ)过度激活，导致氧自由基大量产生[8]。细胞内过量的氧自由基可直接损毁细胞膜或造成线粒体和溶酶体膜损伤，从而使细胞发生崩解、坏死[9]。

现有研究表明坏死性凋亡与凋亡、自噬之间形态学具有明显区别，三者的特征可以通过光、电镜观察及碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色得到明确区分，但是它们之间具有一些共同的调控机制[2-3]。半胱天冬酶-8(caspase-8)是细胞凋亡发生的执行者和中心环节， caspase-8聚集可导致自我活化并激活外源性凋亡通路，同时促进RIP1和RIP3降解，导致坏死性凋亡信号通路关闭[10]。Fas相关死亡结构域(Fas associated death domain，FADD)是死亡受体介导外源性凋亡通路的关键因子，研究表明在RIP1和RIP3形成的坏死复合物中含有可募集caspase-8的FADD，在caspase抑制条件下FADD可能参与了坏死复合体形成的调控过程[11]。另有研究探讨了Nec-1对脑损伤的作用及其与细胞死亡途径的关系，发现Nec-1不仅能阻断坏死性凋亡发生，还可明显抑制凋亡相关蛋白caspase-3和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)及自噬相关蛋白Bcl-2同源结构域蛋白(Beclin-1)表达，提示Nec-1可能通过抑制坏死性凋亡、凋亡及自噬相关蛋白表达而发挥神经保护作用[12]。

2 坏死性凋亡与中枢神经系统退行性疾病的相关研究

2.1 AD AD是一种以进行性痴呆为主要特征的神经退行性疾病，临床表现为学习记忆功能改变，严重影响了人类健康。随着全球人口老龄化，AD发病率持续增高。目前对症治疗是AD的主要治疗方法，但尚不能完全控制其病程进展，寻求安全有效的新药成为AD治疗的迫切需要。有研究证实雷帕霉素(rapamycin)对于阻断AD发生具有一定作用，其机制与调控坏死性凋亡信号通路相关[4，13]。β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)斑块沉积是AD的特征性病理表现，研究证实Aβ聚集后具有神经毒性，可破坏细胞稳态平衡及引起神经元死亡，最终损害大脑认知功能[14]。24S-羟基胆固醇(24S-OHC)是胆固醇24-羟化酶的产物，主要在脑组织中生成并参与维持脑代谢平衡。研究证实24S-OHC可诱导神经元发生坏死性凋亡，并且参与了神经元细胞中Aβ的生成过程，提示调控脑组织中24S-OHC水平可能是预防AD发生的新策略[15-16]。

目前研究证实氧化应激和线粒体功能障碍在AD发病过程中发挥了重要作用。聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)是其重要调控分子[17]。有学者证实除Nec-1外，PARP特异性抑制剂PJ34盐酸盐(PJ34)可抑制谷氨酸盐诱导的海马神经元细胞系(HT22)发生坏死性凋亡，提示PARP活化在谷氨酸盐诱导的坏死性凋亡过程中起到关键作用[17]。该研究进一步分析了Nec-1与PARP之间的作用关系，证实Nec-1可抑制PARP及其下游信号分子的活性，但是不能阻断PARP活化剂诱导的细胞死亡，因此推测Nec-1对PARP并无直接抑制作用，其作用靶点位于PARP上游[18]。作为神经退行性病变的一种恶化因素，铝被认为是其病因学中的风险因子。有学者采用新生小鼠原代培养的大脑皮层细胞进行研究，证实Nec-1可阻断铝诱导的细胞死亡并呈剂量依赖性；体内实验进一步证实Nec-1可改善铝诱导的小鼠学习记忆功能损伤、减少神经元死亡和抑制相关蛋白的表达[19]。由此可见，铝诱导发生的神经退行性病变可能与坏死性凋亡相关，而Nec-1对于预防和治疗AD发生可能具有潜在的作用。

2.2 PD PD是中老年人常见的一种神经退行性疾病，其主要病理特征表现为黑质多巴胺能神经元大量丢失和残存神经元细胞内形成路易小体(一种以α-synuclein为主要成分的嗜酸性包涵体)。PD 的临床表现包括运动迟缓、震颤和强直等，目前应用的治疗手段主要是改善其症状，尚不能完全阻止病情进展。现有研究表明代谢型谷氨酸受体Ⅱ/Ⅲ(mGluR Ⅱ/Ⅲ)可能是对症治疗PD的潜在靶点[20]，该研究中采用人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞和线粒体神经毒性试剂1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)建立PD体外模型，证实mGluR Ⅱ/Ⅲ活化剂对MPP+诱导的细胞死亡具有保护作用，而且Nec-1可阻断其作用[20]。该研究提示mGluR Ⅱ/Ⅲ活化剂可通过调控坏死性凋亡信号通路而发挥神经保护作用。另外，已有研究表明慢性神经炎性反应是诱导多巴胺能神经元变性死亡的主要诱因[21-22]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是参与调控神经炎性反应的关键因子，有研究证实TNF-α水平增高与PD发生密切相关[21]。还有研究发现脑室内注射TNF-α后可激活小鼠海马坏死性凋亡信号通路并诱导神经元丢失，而RIP3基因敲除可抑制该现象[22]，该研究表明RIP3可能是TNF-α诱导神经元发生坏死性凋亡的关键调控分子。

2.3 ALS ALS是一种以脊髓、脑干及运动皮质的运动神经元发生进行性退变为特征的疾病，临床表现为进行性四肢无力、肌肉痉挛和肌萎缩。大部分ALS是散发性病变，其病因尚不清楚。氧化应激损伤、神经炎性反应及线粒体功能障碍均为ALS的致病因素[23]。有研究采用来源于散发性ALS患者的原代培养星形胶质细胞与人胚胎干细胞来源的运动神经元建立共培养模型，结果发现星形胶质细胞可分泌神经毒性因子，并通过坏死性凋亡途径选择性杀死运动神经元，并且该过程主要由RIP1调控[24]。另有研究表明约有5%～10%的ALS是家族性病变，家族性ALS中约20%的疾病发生与人类超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)基因错义突变相关[25]。目前应用于ALS研究的体外模型之一是可表达SOD1突变体(SOD1G93A)的星形胶质细胞，该细胞模型可诱发神经炎性反应，并且能模拟ALS发病进程。已有研究证实在运动神经元和SOD1G93A星形胶质细胞共培养的ALS离体模型中，重复加入ATP或P2X7激动剂能够过度兴奋星形胶质细胞并诱导运动神经元发生坏死性凋亡，并且该过程可被Nec-1阻断[26]。以上研究提示，坏死性凋亡涉及ALS发生机制并且可能为ALS治疗提供新的线索。

3 坏死性凋亡的抑制剂

目前针对坏死性凋亡的抑制剂在不同疾病动物模型中均已取得一定疗效[27]，这表明以坏死性凋亡信号通路为靶点的治疗药物有望运用于神经退行性疾病的临床治疗。除了特异性抑制剂Nec-1外，学者们正试图找到其他有效的抑制剂。有学者发现两种抗癌化合物帕纳替尼(ponatinib)和帕唑帕尼(pazopanib)具有抑制坏死性凋亡的作用，均可抑制在人源性细胞中由死亡配体诱导发生的坏死性凋亡[27]。另外，研究认为RIP1和RIP3是坏死性凋亡发生的关键分子，而HSP90抑制剂可通过影响RIP3和RIP1蛋白稳定性，进而干扰坏死性凋亡的发生过程[28]。由此可见，针对HSP90蛋白功能调控也可能是涉及坏死性凋亡抑制剂的一种新的策略。

综上可见，坏死性凋亡涉及多种中枢神经系统退行性疾病，包括AD、PD、ALS等的发生机制，但是其具体的分子调控机制仍不十分清楚。深入研究坏死性凋亡对中枢神经系统功能的调控及其与相关信号通路的关系，将有助于进一步阐明中枢神经系统退行性疾病的发病机制，而以坏死性凋亡信号通路为靶点的治疗药物有望运用于神经退行性疾病的临床治疗。

[1][1]Fayaz SM, Suvanish Kumar VS, Rajanikant GK. Necroptosis: who knew there were so many interesting ways to die? [J] .CNS Neurol Disord Drug Targets, 2014, 13(1): 42-51.

[2]Walsh CM. Grand challenges in cell death and survival: apoptosisvs. necroptosis[J]. Front Cell Dev Biol, 2014, 2(2): 3.

[3]Wang YQ, Wang L, Zhang MY, et al. Necrostatin-1 suppresses autophagy and apoptosis in mice traumatic brain injury model[J]. Neurochem Res, 2012, 37(9): 1849-1858.

[4]Maiese K. Taking aim at Alzheimer's disease through the mammalian target of rapamycin[J]. Ann Med, 2014, 46(8): 587-596.

[5]Zhang YY, Liu H. Connections between various trigger factors and the RIP1/ RIP3 signaling pathway involved in necroptosis[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(12): 7069-7074.

[6]Degterev A, Zhou W, Maki JL, et al. Assays for necroptosis and activity of RIP kinases[J].Enzymol, 2014, 545(1): 1-33.

[7]McQuade T, Cho Y, Chan FK. Positive and negative phosphorylation regulates RIP1- and RIP3-induced programmed necrosis[J]. Biochem J, 2013, 456(3): 409-415.

[8]Zhang DW, Shao J, Lin J, et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF -induced cell death from apoptosis to necrosis[J]. Science, 2009, 325(5938): 332-336.

[9]Ray PD, Huang BW, Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling[J]. Cell Signal, 2012, 24(5): 981-990.

[10]Günther C, Martini E, Wittkopf N, et al. Caspase-8 regulates TNF-α-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis[J]. Nature, 2011, 477(7364): 335-339.

[11]Lee EW, Kim JH, Ahn YH, et al. Ubiquitination and degradation of the FADD adaptor protein regulate death receptor-mediated apoptosis and necroptosis[J]. Nat Commun, 2012, 3(5): 978.

[12]Chang P, Dong W, Zhang M, et al. Anti-necroptosis chemical necrostatin-1 can also suppress apoptotic and autophagic pathway to exert neuroprotective effect in mice intracerebral hemorrhage model[J]. J Mol Neurosci, 2014, 52(2): 242-249.

[13]Liu Q, Qiu J, Liang M, et al. Akt and mTOR mediate programmed necrosis in neurons[J]. Cell Death Dis, 2014, 5(2): e1084.

[14]Han SH, Park JC, Mook-Jung I. Amyloid β-interacting partners in Alzheimer's disease: From accomplices to possible therapeutic targets[J]. Prog Neurobiol, 2015, 137(2): 17-38.

[15]Vo DK, Urano Y, Takabe W, et al. 24(S)-hydroxycholesterol induces RIPK1-dependent but MLKL-independent cell death in the absence of caspase-8[J]. Steroids, 2015, 99(Pt B): 230-237.

[16]Noguchi N, Saito Y, Urano Y. Diverse functions of 24(S)-hydroxycholesterol in the brain[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 446(3): 692-696.

[17]Verdile G, Keane KN, Cruzat VF, et al. Inflammation and oxidative stress: The molecular connectivity between insulin resistance, obesity, and Alzheimer’s disease[J]. Mediators Inflamm, 2015, 2015(11): 105828.

[18]Xu X, Chua CC, Zhang M, et al. The role of PARP activation in glutamate-induced necroptosis in HT-22 cells[J]. Brain Res, 2010, 1343(7): 206-212.

[19]Qinli Z, Meiqing L, Xia J, et al. Necrostatin-1 inhibits the degeneration of neural cells induced by aluminum exposure[J]. Restor Neurol Neurosci, 2013, 31(5): 543-555.

[20]Jantas D, Greda A, Golda S, et al. Neuroprotective effects of metabotropic glutamate receptor group Ⅱ and Ⅲ activators against MPP(+)-induced cell death in human neuroblastoma SH-SY5Y cells: the impact of cell differentiation state[J]. Neuropharmacology, 2014, 83(8): 36-53.

[21]Fischer R, Maier O. Interrelation of oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease: role of TNF[J]. Oxid Med Cell Longev, 2015, 2015(3): 610813.

[22]Liu S, Wang X, Li Y, et al. Necroptosis mediates TNF-induced toxicity of hippocampal neurons[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014(7): 290182.

[23]Komine O, Yamanaka K. Neuroinflammation in motor neuron disease[J]. Nagoya J Med Sci, 2015, 77(4): 537-549.

[24]Re DB, Le Verche V, Yu C, et al. Necroptosis drives motor neuron death in models of both sporadic and familial ALS[J]. Neuron, 2014, 81(5): 1001-1008.

[25]Kaur SJ, McKeown SR, Rashid S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Gene, 2016, 577(2):109-118.

[26]Pirooznia SK, Dawson VL, Dawson TM. Motor neuron death in ALS: programmed by astrocytes[J]? Neuron, 2014, 81(5): 961-963.

[27]Fauster A, Rebsamen M, Huber KV, et al. A cellular screen identifies ponatinib and pazopanib as inhibitors of necroptosis[J]. Cell Death Dis, 2015, 6(5): e1767.

[28]Park SY, Shim JH, Chae JI, et al. Heat shock protein 90 inhibitor regulates necroptotic cell death via down-regulation of receptor interacting proteins[J]. Pharmazie, 2015, 70(3):193-198.

(本文编辑：邹晨双)

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.02.016

国家自然科学基金资助项目(81060111)；江西省卫计委中医药科研基金重点资助项目(2013Z005)；江西省杰出青年人才资助计划(20162BCB23056)作者单位：330006江西省人民医院临床医学研究所

刘勇，Email：jxpathology@126.com

R741.02

A

1006-2963(2017)02-0143-04

2016-01-20)