p38 MAPK在EAE小鼠免疫致炎机制中的研究进展

全墨缘 邓晓红 刘会佳 王梁 郭力

p38 MAPK在EAE小鼠免疫致炎机制中的研究进展

全墨缘 邓晓红 刘会佳 王梁 郭力

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统(central nervous system，CNS)脱髓鞘性疾病，其病因及发病机制尚不清楚。一般认为，CD4+T细胞异常活化及多种细胞参与的炎性反应瀑布为主要机制之一。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠为研究MS公认的动物模型。实验研究证实，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPKs)在EAE发生和发展过程中发挥重要作用。本文对p38 MAPK在EAE小鼠免疫致炎机制中的研究进展进行综述，以期为进一步实验室研究和临床治疗MS提供思路。

多发性硬化；脑脊髓炎，自身免疫性，实验性；p38丝裂原活化蛋白激酶；进展

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统(central nervous system，CNS)白质脱髓鞘性自身免疫疾病，临床上呈反复发作与缓解病程，是青年人最常见的非外伤性神经系统疾患之一。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠为研究MS的公认动物模型，以神经炎性反应、脱髓鞘、轴索损伤和进行性神经功能障碍为特点[1]，且具有慢性或复发缓解的病程，与MS的病理表现和发病过程极为相似。

目前，MS的病因及发病机制尚无定论，一般认为涉及免疫炎性反应、病毒感染、环境及遗传等多种因素，其中CD4+T淋巴细胞异常活化及多种炎症细胞和CNS定植细胞参与的炎性反应瀑布是最重要的致病机制之一。这些细胞分泌的毒性产物和促炎介质可导致髓鞘破坏、脱失及轴索损伤，进而引起MS患者神经功能障碍。

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)家族中的重要组成部分，主要在细胞应激、炎性刺激时被激活，其主要包括p38α、p38β、p38γ、p38δ 4种亚型，其中前两者分布广泛，几乎所有组织均可表达；而在CNS内T淋巴细胞、树突细胞中以p38α表达为主。p38 MAPK的信号转导途径为经典的磷酸化级联反应，MKK3与MKK6是公认的p38上游激酶，能直接磷酸化p38MAPK苏氨酸180、酪氨酸182双位点而使其激活。此外，在T细胞中还存在不依赖MAPK激酶的p38MAPK自身磷酸化激活途径，即通过T细胞受体(T cells receptor，TCR)途径引起ζ链相关蛋白-70(ζ-chain associated protein-70，ZAP-70)激活，后者在单一苏氨酸323位点磷酸化p38MAPK，之后其可发生自身磷酸化激活[2]。

有实验证实，两种途径激活的p38MAPK均可促进多种促炎介质和T细胞极化因子〔如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INF-γ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-12、IL-6和IL-2〕的产生[3]；且其在复发缓解型MS患者CNS内记忆淋巴细胞释放IL-17中发挥巨大促进作用[4]。将人外周血中树突状细胞和初始T淋巴细胞共培养，加入p38MAPK抑制剂后发现，IL-6及IL-17表达量下降[5]。p38α的表达在MS患者CNS病灶内显著升高。并且，有研究证实EAE小鼠CNS内炎性细胞和神经胶质内活化的p38MAPK水平上升[6]。应用p38α/β抑制剂可减轻小鼠EAE的症状，且在EAE起病后应用药物，可延缓病程进展[7-8]。此外，在EAE缓解期应用p38MAPK抑制剂，其复发症状也会相应减轻[7]。除药物干预手段外，应用基因敲除p38α可使EAE小鼠神经损害症状减轻[8]。

由此可见，p38MAPK信号通路在MS和EAE发生、发展和EAE复发中均发挥重要作用。但其确切致病机制仍不甚清晰，很多研究显示，激活的p38MAPK广泛分布于参与炎性反应瀑布的多种细胞内。本文就p38MAPK在EAE小鼠多种炎性反性及定植细胞中参与免疫致炎作用机制的研究进展进行综述。

1 p38MAPK在CD4+T淋巴细胞中的免疫致炎作用

在诸多免疫细胞中，病原相关性CD4+T细胞介导的免疫反应对CNS髓鞘的攻击是造成白质病灶的重要原因[9]。CD4+T细胞可以定向分化成不同的T细胞亚群，包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞等。早期观点认为，Th1细胞是MS致病的主要亚群，而近年来发现Th17细胞在MS和EAE的病理过程中同样具有关键作用而受到广泛关注[10-11]。

既往研究表明，上述MKK6经典途径激活的p38MAPK在调节Th1细胞免疫致炎过程中发挥重要作用[12]。Jirmanova 等[13]的研究进一步发现，TCR途径激活的p38α同样促进Th1细胞产生促炎因子IFN-γ。因此，两种途径激活的p38MAPK均在Th1细胞参与EAE发病中发挥重要作用。

近年来，诸多实验表明，T细胞中的p38MAPK信号通路调节Th17细胞功能，进而参与EAE发病。有研究结果显示，选择性抑制B10.BR小鼠T细胞中的p38MAPK可使IL-17表达下降，EAE神经损害轻；而特异性激活T细胞中p38MAPK时，可使IL-17表达增多，加重EAE病情[7]。另外，Jirmanova等[14]通过特异性抑制小鼠T细胞中TCR途径激活的p38MAPK发现，小鼠体内的Th17细胞功能受到抑制，EAE起病晚、症状轻、恢复快。因此，p38MAPK参与Th17细胞分泌IL-17，进而在EAE的发病过程中发挥重要作用。研究进一步发现，p38MAPK参与Th17细胞分泌IL-17的过程分别在转录水平和翻译水平上进行。一方面，就转录水平而言，p38α可以激活活性转录因子2/环磷腺苷效应元件结合蛋白(activating transcription factor 2/cAMP-response element binding protein，ATF2/CREB)，使其结合于IL-17基因的环磷腺苷效应元件(cAMP-response element，CRE)，促进IL-17的转录[8]；另一方面，在翻译水平上，p38MAPK通过激活真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，elf-4E)促进胞质中IL-17 mRNA翻译，进而增加IL-17表达[7]。

另外，p38MAPK还能通过促进T细胞穿过血-脑脊液屏障进入CNS，从而加重EAE的发病[15]。因此，p38MAPK不仅在转录和翻译水平促进Th17细胞分泌IL-17，还可通过促进T细胞向CNS的迁移参与Th17细胞在EAE中的致病作用。

最新研究表明，长链脂肪酸饮食通过p38MAPK促进Th1和Th17细胞分化和增殖，可加重EAE发病，而短链脂肪酸饮食通过抑制p38MAPK和氨基末端激酶1 (junN-terminal kinase 1，JNK1)通路缓解EAE发病[16]。另外，高盐饮食的小鼠EAE起病早，发病重，其机制也涉及p38MAPK的激活。高盐饮食可激活T细胞中p38MAPK/活化T细胞核因子5/糖皮质激素诱导激酶1通路(p38MAPK/nuclear factor of activated T-cells 5/glucocorticoid-induced kinase 1，p38MAPK/NFAT5/SGK1)，进而稳定Th17细胞的表型，促进IL-17表达，加重小鼠EAE发病[17-18]。由此可见，T细胞中p38MAPK异常激活，为探讨不良饮食习惯与MS发病的相关性提供了部分理论依据。

然而，Krementsov等[19]的研究结果显示，敲除T细胞中p38α的C57BL/6小鼠EAE的发病无明显减轻。造成这种差异的可能原因为，T细胞中p38MAPK其他亚型可能同样发挥致病作用，或C57BL/6小鼠和B10.BR小鼠间的基因差异。

综上所述，p38MAPK通过影响Th1、Th17细胞的免疫致炎作用和迁移等机制参与EAE发病，也提示不良饮食习惯在EAE加重过程中发挥重要作用。

2 p38MAPK在树突细胞中的免疫致炎作用

树突细胞是功能最强的抗原提呈细胞，可以显著刺激初始T细胞活化增殖，是适应性T细胞免疫应答的始动者。有研究结果显示，条件性敲除树突细胞中p38α的EAE小鼠起病晚[15，19]，神经损害症状较轻，CNS炎性浸润及脱髓鞘程度较低，中枢神经系统内IL-17a、IL-17f和IL-23的mRNA表达量均下降，且CNS内IL-17+CD4+T细胞较少[15]；并且将T细胞和敲除p38α的树突细胞共培养发现，Th17细胞的特异性细胞因子(如IL-17a)、转录因子(如RORγt和RORα)的基因表达下降[15]；分离p38α△DC EAE小鼠脾中的树突细胞进行培养发现，其表达的促进Th17细胞分化的细胞因子IL-6表达下降，而抑制Th17细胞分化的细胞因子IL-27表达水平增高[15]。Wei等[20]证实p38MAPK参与腺苷诱导树突细胞产生IL-6的过程，进而调节Th17细胞的分化和加重EAE。由此证实，p38 MAPK可以通过干预树突细胞，进而影响CD4+T细胞分化，参与EAE的发病。

3 p38MAPK在髓样细胞中的免疫致炎作用

髓样细胞的p38α对雌性和雄性C57BL/6 EAE小鼠的发病具有双向调节作用，当选择性敲除髓样细胞中p38α后，雌性小鼠的EAE发病有所减轻，而雄性小鼠EAE起病早、发病重[19]。其原因可能是依赖p38α抗炎因子和促因子的表达在雄性和雌性小鼠中存在差异。在特异性敲除髓样细胞p38α的雄性小鼠体内，抗炎因子IL-10 mRNA表达下调，而在敲除上述基因的雌性小鼠体内，促炎因子Oas1g mRNA(Oas1g是一种促炎性反应因子，其同人体内表达的OAS1为种间同源基因，而OAS1同MS的易感性和发病严重性相关)表达下调[19]；IL-10和Oas1g均为小鼠CNS神经炎性反应中受p38α调节的性别相关EAE发病的特异性因子。最近Huang等[5]研究发现，敲除髓样细胞p38α不影响EAE的发病，但Huang等并未指出小鼠的性别差异对结果的影响，且该研究应用百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)作为佐剂来诱导EAE发病，而PTX可能会破坏许多基因位点，因此推测PTX破坏的基因位点正是髓样细胞中p38α发挥作用的关键。

因此，髓样细胞中p38MAPK可能参与MS发病的性别倾向。

4 p38MAPK在胶质细胞中的免疫致炎作用

星形胶质细胞和小胶质细胞是存在于CNS内最广泛的细胞类型，具有分泌趋化因子和抗原呈递等功能，可潜在影响免疫反应。EAE小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞Toll样受体(toll like receptors，TLRs)表达上调，TLRs可以协同上述两种细胞中的ASK1 /p38MAPK(apoptosis signal-regulating kinase1/p38MAPK，ASK1/p38MAPK)通路，发挥促进MCP1、RANTES、MIP-1α等致病关键性趋化因子释放的作用[21]。应用p38MAPK抑制剂后，上述趋化因子的表达受到抑制[21]；另外，应用ASK1抑制剂或敲除星形胶质细胞ASK1后，p38MAPK表达下降，TLRs诱导的上述趋化因子水平降低，EAE小鼠脊髓和视神经脱髓鞘程度减轻[21]。

星形胶质细胞、胚胎成纤维细胞、神经元中p38α/MAPK磷酸酶1(p38α/MAPK phosphatase 1，p38α/MKP-1)信号通路参与IL-17受体信号通路及多种炎性细胞因子、趋化因子的表达，募集Th1/Th17细胞进入CNS内，从而加重EAE[22]。

因此，p38MAPK参与CNS内多种胶质细胞的免疫致炎作用，并且推测星形胶质细胞和小胶质细胞中TLRs/ASK1/p38MAPK通路参与EAE小鼠脊髓和视神经脱髓鞘病灶的形成。

5 p38MAPK在神经干细胞中的免疫致炎作用

神经干细胞是唯一同胚胎干细胞具有类似作用的神经细胞，主要存在于侧脑室和海马。神经干细胞具有自我更新和定向分化的能力，可以分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的前体细胞，从而完成髓鞘再生和神经修复的作用。在MS和EAE的炎性病灶处，神经干细胞的迁移和分化能力降低，进行髓鞘再生和神经修复的能力较低。有研究表明，IL-17可以直接抑制神经干细胞的增殖和分化，并且此时细胞内p38MAPK的表达增多；而当利用p38MAPK抑制剂干预时，IL-17对神经干细胞的抑制作用相应减弱[23]。因此，p38MAPK可通过抑制神经干细胞介导的髓鞘再生和神经修复过程，从而加重EAE的病理表现和发病症状。

综上所述，一方面p38MAPK在多种适应性和固有免疫细胞、CNS的定植细胞等多种细胞中参与免疫炎性损伤，加重EAE发病；p38MAPK在高盐及长链脂肪酸饮食、性别因素对EAE发病的影响和视神经脱髓鞘的机制等诸多方面提供部分合理解释；另外，许多药物如INF-β[24]可以通过抑制p38MAPK发挥良好治疗作用，p38MAPK作为治疗MS的靶点具有巨大潜力。另一方面，也有少部分研究结果显示，p38MAPK在无应激刺激时，对少突胶质细胞具有保护性作用，促进髓鞘形成[25-27]，但p38MAPK在促进髓鞘生成和加剧髓鞘脱失双向作用的产生条件，p38MAPK在各种细胞中发挥作用的上游及下游确切的信号通路，各个亚型和不同激活途径在MS及EAE中的具体作用，仍未完全阐明，有待进一步研究和探索。

[1]Stromnes IM, Goverman JM. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis[J]. Nat Protoc, 2006,1(4): 1810-1819.

[2]Mittelstadt PR, Yamaguchi H, Appella E, et al. T cell receptor-mediated activation of p38{alpha} by mono-phosphorylation of the activation loop results in altered substrate specificity[J]. J Biologic Chem, 2009, 284(23):15469-15474.

[3]Lock C, Hermans G, Pedotti R, et al. Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis [J]. Nat Med, 2002, 8(5): 500-508.

[4]Mitri DD, Sambucci M, Loiarro M, et al. The p38 mitogen-activated protein kinase cascade modulates T helper type 17 differentiation and functionality in multiple sclerosis[J]. Immunology, 2015, 146(2):251-263.

[5]Huang G, Wang Y, Vogel P, et al. Signaling via the kinase p38 [alpha] programs dendritic cells to drive TH17 differentiation and autoimmune inflammation[J]. Nat Immunol, 2012, 13(2): 152-161.

[6]Shin T, Ahn M, Jung K, et al. Activation of mitogen-activated protein kinases in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Neuroimmunol, 2003, 140(1-2): 118-125.

[7]Noubade R, Krementsov DN, Del RR, et al. Activation of p38 MAPK in CD4 T cells controls IL-17 production and autoimmune encephalomyelitis[J]. Blood, 2011, 118(12): 3290-3300.

[8]Namiki K, Matsunaga H, Yoshioka K, et al. Mechanism for p38α-mediated experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Biologic Chem, 2012, 287(29): 24228-24238.

[9]Greenstein JI. Current concepts of the cellular and molecular pathophysiology of multiple sclerosis[J]. Develop Neurobiol, 2007, 67(9): 1248-1265.

[10]Segal BM. Th17 cells in autoimmune demyelinating disease[J].Semin immunopathol，2010, 32(1): 71-77.

[11]Awasthi A, Kuchroo VK. Th17 cells: from precursors to players in inflammation and infection[J]. Inter Immunol, 2009, 21(5): 489-498.

[12]Rincón M, Enslen H, Raingeaud J, et al. Interferon-γ expression by Th1 effector T cells mediated by the p38 MAP kinase signaling pathway[J]. The Embo J, 1998, 17(10): 2817-2829.

[13]Jirmanova L, Sarma DN, Jankovic D, et al. Genetic disruption of p38αTyr323 phosphorylation prevents T-cell receptor-mediated p38α activation and impairs interferon-gamma production[J]. Blood, 2009, 113(10): 2229-2237.

[14]Jirmanova L, Giardino Torchia ML, Sarma ND, et al. Lack of the T cell-specific alternative p38 activation pathway reduces autoimmunity and inflammation[J]. Blood, 2011, 118(12): 3280-3289.

[15]Sagar D, Lamontagne A, Foss CA, et al. Dendritic cell CNS recruitment correlates with disease severity in EAE via CCL2 chemotaxis at the blood-brain barrier through paracellular transmigration and ERK activation[J]. J Neuroinflamm, 2012, 9(1): 245.

[16]Haghikia A, Jörg S, Duscha A, et al. Dietary fatty acids directly impact central nervous system autoimmunity via the small intestine.[J]. Immunity, 2015, 43(4):817-829.

[17]Kleinewietfeld M, Manzel A, Titze J, et al. Sodium chloride drives autoimmune disease by the induction of pathogenic TH17 cells[J]. Nature, 2013, 496(7446):518-522.

[18]Wu C, Yosef N, Thalhamer T, et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1[J]. Nature, 2013, 496(7446):513-517.

[19]Krementsov DN, Noubade R, Dragon JA, et al.Sex-specific control of central nervous system autoimmunity by p38 mitogen-activated protein kinase signaling in myeloid cells[J].Ann Neurol，2014,75(1):50-66.

[20]Wei W, Du C, Lv J, et al. Blocking A2B adenosine receptor alleviates pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis via inhibition of IL-6 production and Th17 differentiation[J]. J Immunol, 2013, 190(1): 138-146.

[21]Guo X, Harada C, Namekata K, et al. Regulation of the severity of neuroinflammation and demyelination by TLR-ASK1-p38 pathway[J]. EMBO Mol Med, 2010, 2(12): 504-515.

[22]Huang G, Wang Y, Vogel P, et al. Control of IL-17 receptor signaling and tissue inflammation by the p38α-MKP-1 signaling axis in a mouse model of multiple sclerosis[J]. Sci Signal, 2015, 8(366):ra24-ra24.

[23]Zichen L, Ke L, Lin Z, et al. Inhibitory effect of IL-17 on neural stem cell proliferation and neural cell differentiation.[J]. Bmc Immunol, 2013, 14(1):1-10.

[24]Filippo MD, Tozzi A, Tantucci M, et al. Interferon-γ 1a protects neurons against mitochondrial toxicity via modulation of STAT1 signaling: Electrophy siological evidence[J]. Neurobiol Dis, 2014, 62:387-393.

[25]Chew LJ, Coley W, Cheng Y, et al. Mechanisms of regulation of oligodendrocyte development by p38 mitogen-activated protein kinase[J]. J Neurosci, 2010, 30(33):11011-11027.

[26]Runchel C, Matsuzawa A, Ichijo H. Mitogen-activated protein kinases in mammalian oxidative stress responses[J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 15(1): 205-218.

[27]Cui QL, Fang J, Kennedy TE, et al. Role of p38MAPK in S1P receptor-mediated differentiation of human oligodendrocyte progenitors[J]. Glia, 2014, 62(8):1361-1375.

(本文编辑：时秋宽)

10.3969/j.issn.1006-2963.2007.02.013

国家自然基金资助项目(编号81471228)

050000 河北医科大学第二医院神经内科 河北省神经病学重点实验室

郭力，Email：guoli6@163.com

R744.5+1

A

1006-2963(2017)02-0129-04

2016-04-22)