体外组织培养法保存关节软骨的研究进展

韩运宁，亓建洪

体外组织培养法保存关节软骨的研究进展

韩运宁，亓建洪

同种异体软骨移植是成功治疗大面积关节软骨缺损的一种选择。大量研究报道，异体骨软骨移植后软骨移植物的存活率较高，10 年存活率在 71% ～ 85% 之间，15 年存活率高达 74%，20 年存活率可以达到 66%[1]。相对于关节置换手术，同种异体软骨移植术后的患者恢复快、效果好。运动人群中 88% 的病人可重新运动，其中 79% 的病人可以恢复到受伤前的运动水平[2]。总体来说，同种异体骨软骨移植治疗已经取得很好的效果。然而，在保存期间软骨细胞生物活性的降低限制了同种异体软骨移植的应用。有研究发现保存 7 d 内的软骨细胞活性最适合应用于临床，超过这个时间软骨细胞活性明显降低[3-4]，当移植物细胞存活率低于70% 时，手术效果很不理想[5]。而异体软骨在移植到患者之前需要经历移植物的转运、病原检查等必要步骤，至少需要 1 ～ 2 周的时间。因此延长体外软骨的保存时间，并维持其原有的生物学、生物力学特性，对于扩大软骨移植临床应用与提高移植效果尤为重要，也是同种异体软骨移植手术成功与否的关键。目前体外软骨保存的方法有冷冻保存法、组织培养法等。有实验研究显示组织培养法的保存效果要优于冷冻保存法[6-8]，且保存时间最长可达 60 d[9]。因此如何进一步地提高组织培养法保存软骨的效果成为研究的热点及难点，本文主要从软骨保存液的成分和保存环境两个方面综述，以寻求更理想的保存方法。

1 保存环境

1.1 保存温度

目前组织培养法保存关节软骨常用的保存温度为 4 ℃、37 ℃ 和 25 ℃。4 ℃ 条件下可以减缓软骨细胞的代谢，维持原有的细胞外基质成分。LaPrade 等[10]在 4 ℃ 条件下保存软骨 28 d，细胞存活率可以达到 70% 的阈值。Qi 等[11]采用每两天换一次培养液的方法保存软骨，实验结果显示4 ℃ 条件下的保存效果优于 37 ℃ 条件下的保存。有研究人员模拟软骨细胞生存的生理温度，即在 37 ℃ 条件下保存软骨。Garrity 等[12]用一种无血清的保存液在 37 ℃ 下保存狗的膝关节软骨 56 d，软骨细胞存活率可以达到 70%。相比 4 ℃ 下保存，软骨细胞存活率有了明显的提高。但是黏多糖、胶原蛋白含量和生物力学性能与 4 ℃ 下保存效果相比没有明显差异。Pallante 等[13]研究发现，37 ℃ 保存软骨 28 d 后检测软骨细胞存活率，软骨表面的细胞存活率可达 80%，浅层区域为 65%，中层为 70%。而该实验中 4 ℃保存条件下的细胞存活率分别只有 45%、20%、35%。Cook等[9]在室温下，即在 25 ℃ 下用 MOPS 保存液保存羊关节软骨获得了理想的结果。由于保存液的成分和实验条件的不同，4 ℃、37 ℃ 和 25 ℃ 下的保存效果尚存在争议，需要根据自己的实验条件选择合适的保存温度。

1.2 换液频率

组织培养法保存软骨与培养细胞类似，需要定期更换培养液。保存软骨时多采用 2 d 更换一次培养液的方式来为体外软骨提供足够的营养，维持其基本代谢[11]。但换液频率对保存效果的影响尚没有相关的研究。

1.3 应力环境

正常的软骨在体内会受到周期性应力的作用，有利于软骨细胞吸收关节液中的营养物质。组织培养法保存软骨与体内软骨相比缺乏必需的应力刺激，影响软骨细胞的正常代谢。Diao 等[14]发现，动态循环的压力刺激可以使调控软骨生成的基因 SOX9 表达升高，同时降低软骨细胞的代谢。杨健等[15]以一种非接触性的力学加载形式作用于液体保存中的软骨，对细胞外基质结构产生积极的作用。但是不同强度的压力对软骨细胞产生的作用不同，不合适的压力会对软骨细胞的增殖和凋亡产生负性作用[16]。以上实验表明适当的应力刺激对软骨细胞会产生积极的作用，因此软骨保存所需的应力环境也是今后组织培养法保存关节软骨方案的优化方向。

2 保存液成分

随着各种器官及组织移植技术的迅速发展，各国研究人员对组织培养液的研究越来越多。软骨的组织培养液有很多种类，其中常用的组织培养液有最低必需培养液（Eagle's minimum essential medium，EMEM）、Iscove’s 改良培养液（IMDM）、Dulbecco’s 改良 Eagle 培养液（DMEM）、威斯康星大学液（UW 液）、RPMI1640 培养液以及乳酸林格液等。培养液的成分成为影响保存效果的重要因素，研究人员通过对已有培养液进行处理，加入血清、蛋白、生长因子、细胞凋亡抑制剂、抗氧化剂等，使得软骨保存的效果得到了提升。

2.1 血清

血清中含有丰富的细胞生长必需的营养成分，在细胞培养和软骨组织的保存中都有应用。Pennock 等[17]向 EMEM培养液中加入 10% 的新鲜胎牛血清（FBS）保存关节软骨。在 4 ℃ 条件下保存 28 d 后，研究发现含有新鲜胎牛血清的保存液保存的软骨细胞存活率可达 68%，而无血清的培养液保存的软骨细胞活性只有 27%。但软骨基质中黏多糖的含量并没有明显的差异。Onuma 等[18]向 UW 液中加入10% 同种异体血清，4 ℃ 条件下保存小鼠软骨。实验发现软骨细胞存活率和细胞外基质成分均得到了提升，血清的加入一定程度上提高了保存效果，但是异体血清可能会引起免疫排斥反应以及增加疾病传播的风险。

2.2 细胞生长因子

人体内存在各种各样的细胞生长因子，能够促进细胞的生长、修复，补充所需营养。Teng 等[19]利用含有胰岛素样生长因子（IGF-I）的 DMEM 培养液，4 ℃ 条件下保存牛关节软骨，21 d 后进行细胞活性检测发现细胞存活率高于不含胰岛素样生长因子培养液保存的软骨，但 28 d 后细胞存活率迅速降低。Mickevicius 等[20]的研究也表明 IGF-I 在软骨细胞的体外保存中可以在短时间内起到延长保存时间，提高保存效果的作用。同时，有研究发现转化生长因子（TGF-β）能够促进软骨细胞生长和细胞外基质的生成[21]。

2.3 细胞凋亡抑制剂

细胞凋亡抑制剂在骨关节炎及软骨体外保存的研究中得到了越来越多的应用[22]。在软骨保存期间，细胞凋亡基因随着保存时间的延长会明显上调，导致软骨细胞的凋亡，其中包括肿瘤坏死因子 α（TNF-α）[23]和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）。依那西普是治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎的有效药物，属于 TNF-α 抑制剂。Linn等[24]在 4 ℃ 条件下保存布尔山羊软骨 28 d，发现含有依那西普的保存液保存的表层软骨细胞存活率可以达到69.3%，TNF-α 的表达低于不含依那西普的对照组。但深层软骨细胞的存活率较低，黏多糖成分和组织学观察没有明显差异。Caspase 是一种与细胞凋亡相关的蛋白酶，Teng 等[19]向 DMEM 培养液中加入 caspase 抑制剂 ZVAD-fmk，4 ℃下保存牛关节软骨 21 d 发现，细胞凋亡抑制剂可以使软骨细胞存活率升高，但是继续保存 28 d 后细胞存活率严重降低。

2.4 激素

激素在机体的生长、代谢、发育中起重要的调节作用，在软骨细胞的代谢过程中也具有调节作用。Bian 等[25]在37 ℃ 下，用含有地塞米松的 DMEM 培养液保存牛关节软骨，发现含有地塞米松的 DMEM 培养液对于软骨组织的保存有积极的效果，生物力学性能和细胞外基质成分优于不含地塞米松培养液保存的软骨。表明地塞米松等激素可以成为延长保存效果的有效物质。

2.5 其他

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是从茶叶中提取的茶多酚，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎特性的物质[26]。对于软骨保存也有积极的意义。Bae 等[27]在 4 ℃ 条件下用含有 EGCG 的 RPMI1640PE 培养液保存髋关节软骨和半月板，尽管细胞存活率在保存 14 d 和 28 d 后下降明显，但是 EGCG 能够延缓细胞存活率下降速度。氢气是一种新型的选择性抗氧化剂，同时具有抗凋亡、抗炎作用[28]，对多种疾病具有治疗作用[29-31]，具有广泛的应用前景。Yamada等[32]用含有氢气的保存液来保存小鼠关节软骨，发现氢气可以提高软骨保存效果。含有抗氧化、抗凋亡、抗炎特性物质的保存液成为今后保存液研究的热点。

3 总结与展望

多个临床跟踪研究证明了同种异体软骨移植手术在临床上的成功应用[33-35]。美国同种异体软骨移植手术数量近年迅速增多，由 2005 年的 660 例上升到 2011 年的 1619 例，同种异体软骨移植成为治疗关节软骨疾病的重要方法[36]，而软骨的体外保存效果成为软骨移植手术成功与否的关键。目前我们可以从保存环境和保存液成分来改善软骨的体外保存效果，使得同种异体软骨移植手术得到广泛应用。未来软骨保存液的研究将会从细胞通路、生长因子、应力环境等方面入手，模拟人体关节内环境，解决软骨保存过程中的问题，使同种异体软骨移植手术的应用更加广泛和有效。

[1] Sherman SL, Garrity J, Bauer K, et al. Fresh osteochondral allograft transplantation for the knee： current concepts. J Am Acad Orthop Surg, 2014, 22(2)：121-133.

[2] Krych AJ, Robertson CM, Williams RJ 3rd, et al. Return to athletic activity after osteochondral allograft transplantation in the knee. Am J Sports Med, 2012, 40(5)：1053-1059.

[3] Williams SK, Amiel D, Ball ST, et al. Prolonged storage effects on the articular cartilage of fresh human osteochondral allografts. J Bone Joint Surg Am, 2003, 85-A(11)：2111-2120.

[4] Williams RJ 3rd, Dreese JC, Chen CT. Chondrocyte survival and material properties of hypothermically stored cartilage： an evaluation of tissue used for osteochondral allograft transplantation. Am J Sports Med, 2004, 32(1)：132-139.

[5] Cook JL, Stannard JP, Stoker AM, et al. Importance of donor chondrocyte viability for osteochondral allografts. Am J Sports Med, 2016, 44(5)：1260-1268.

[6] Pallante AL, Chen AC, Ball ST, et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. Am J Sports Med, 2012, 40(8)：1814-1823.

[7] Pallante-Kichura AL, Chen AC, Temple-Wong MM, et al. In vivo efficacy of fresh versus frozen osteochondral allografts in the goat at 6 months is associated with PRG4 secretion. J Orthop Res, 2013, 31(6)：880-886.

[8] Song HQ, Qi JH, Xuan YH, et al. Application of tissue - cultured method on preservation of articular cartilage. Orthoped J China, 2007, 15(17)：1340-1343. (in Chinese)宋洪强, 亓建洪, 玄燕华, 等. 组织培养法在关节软骨保存中的应用. 中国矫形外科杂志, 2007, 15(17)：1340-1343.

[9] Cook JL, Stoker AM, Stannard JP, et al. A novel system improves preservation of osteochondral allografts. Clin Orthop Relat Res, 2014, 472(11)：3404-3414.

[10] LaPrade RF, Botker J, Herzog M, et al. Refrigerated osteoarticular allografts to treat articular cartilage defects of the femoral condyles. A prospective outcomes study. J Bone Joint Surg Am, 2009, 91(4)：805-811.

[11] Qi JH, Hu ZJ, Song HQ, et al. Cartilage storage at 4 degrees C with regular culture medium replacement benefits chondrocyte viability of osteochondral grafts in vitro. Cell Tissue Bank, 2016, 17(3)：473-479.

[12] Garrity JT, Stoker AM, Sims HJ, et al. Improved osteochondral allograft preservation using serum-free media at body temperature. Am J Sports Med, 2012, 40(11)：2542-2548.

[13] Pallante AL, Bae WC, Chen AC, et al. Chondrocyte viability is higher after prolonged storage at 37 degrees C than at 4 degrees C for osteochondral grafts. Am J Sports Med, 2009, 37 Suppl 1：24S-32S.

[14] Diao HJ, Fung HS, Yeung P, et al. Dynamic cyclic compression modulates the chondrogenic phenotype in human chondrocytes from late stage osteoarthritis. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 486(1)：14-21.

[15] Yang J, Huang W, Song GL, et al. Collagen and tissue inhibitor of metalloproteinase-3 expression in human osteochondral allografts in storage media. J Clin Rehabilitative Tissue Eng Res, 2011, 15(33)：6081-6084. (in Chinese)杨健, 黄伟, 宋国立, 等. 应力环境组织培养法保存的人骨软骨移植物中胶原和基质金属蛋白酶组织抑制剂 3. 中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(33)：6081-6084.

[16] Wang X. The effects of different intensity hydrostatic pressure on the biological characteristics of chondrocytes of the knee joint. Xi’an： The Fourth Military Medical University, 2014. (in Chinese)王鑫. 不同强度静水压力对人膝关节软骨细胞生物学特性的影响.西安： 第四军医大学, 2014.

[17] Pennock AT, Wagner F, Robertson CM, et al. Prolonged storage of osteochondral allografts： does the addition of fetal bovine serum improve chondrocyte viability? J Knee Surg, 2006, 19(4)：265-272.

[18] Onuma K, Urabe K, Naruse K, et al. Allogenic serum improves cold preservation of osteochondral allografts. Clin Orthop Relat Res, 2012, 470(10)：2905-2914.

[19] Teng MS, Yuen AS, Kim HT. Enhancing osteochondral allograft viability： effects of storage media composition. Clin Orthop Relat Res, 2008, 466(8)：1804-1809.

[20] Mickevicius T, Pockevicius A, Kucinskas A, et al. Impact of storage conditions on electromechanical, histological and histochemical properties of osteochondral allografts. BMC Musculoskelet Disord, 2015, 16：314.

[21] Poleni PE, Bianchi A, Etienne S, et al. Agonists of peroxisome proliferators-activated receptors (PPAR) alpha, beta/delta or gamma reduce transforming growth factor (TGF)-beta-induced proteoglycans' production in chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage, 2007, 15(5)：493-505.

[22] Huang Y, Wan G., Tao J. C1q/TNF-related protein-3 exerts the chondroprotective effects in IL-1beta-treated SW1353 cells by regulating the FGFR1 signaling. Biomed Pharmacother, 2017, 85：41-46.

[23] Robertson CM, Allen RT, Pennock AT, et al. Upregulation of apoptotic and matrix-related gene expression during fresh osteochondral allograft storage. Clin Orthop Relat Res, 2006, 442：260-266.

[24] Linn MS, Chase DC, Healey RM, et al. Etanercept enhances preservation of osteochondral allograft viability. Am J Sports Med, 2011, 39(7)：1494-1499.

[25] Bian L, Stoker AM, Marberry KM, et al. Effects of dexamethasone on the functional properties of cartilage explants during long-term culture. Am J Sports Med, 2010, 38(1)：78-85.

[26] Rasheed Z, Rasheed N, Al-Shaya O. Epigallocatechin-3-O-gallate modulates global microRNA expression in interleukin-1β-stimulated human osteoarthritis chondrocytes： potential role of EGCG on negative co-regulation of microRNA-140-3p and ADAMTS5. Eur J Nutr, 2017. [Epub ahead of print]

[27] Bae JY, Han DW, Wakitani S, et al. Biological and biomechanical evaluations of osteochondral allografts preserved in cold storage solution containing epigallocatechin gallate. Cell Transplant, 2010, 19(6)：681-689.

[28] Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals. Nat Med, 2007, 13(6)：688-694.

[29] Noda K, Shigemura N, Tanaka Y, et al. A novel method of preserving cardiac grafts using a hydrogen-rich water bath. J Heart Lung Transplant, 2013, 32(2)：241-250.

[30] Chen Y, Zong C, Guo Y, et al. Hydrogen-rich saline may be an effective and specific novel treatment for osteoradionecrosis of the jaw. Ther Clin Risk Manag, 2015, 11：1581-1585.

[31] Zhang X, Liu J, Jin K, et al. Subcutaneous injection of H2 is a novel effective treatment for type 2 diabetes. J Diabetes Investig, 2017. [Epub ahead of print]

[32] Yamada T, Uchida K, Onuma K, et al. Hydrogen supplementation of preservation solution improves viability of osteochondral grafts. ScientificWorldJournal, 2014, 2014：109876.

[33] Gobbi A, Scotti C, Lane JG, et al. Fresh osteochondral allografts in the knee： only a salvage procedure? Ann Transl Med, 2015, 3(12)：164.

[34] Bugbee WD, Pallante-Kichura AL, Görtz S, et al. Osteochondral allograft transplantation in cartilage repair： Graft storage paradigm, translational models, and clinical applications. J Orthop Res, 2016, 34(1)：31-38.

[35] Levy YD, Görtz S, Pulido PA, et al. Do fresh osteochondral allografts successfully treat femoral condyle lesions? Clin Orthop Relat Res, 2013, 471(1)：231-237.

[36] McCormick F, Harris JD, Abrams GD, et al. Trends in the surgical treatment of articular cartilage lesions in the United States： an analysis of a large private-payer database over a period of 8 years. Arthroscopy, 2014, 30(2)：222-226.

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.012

山东省自然科学基金（ZR2013HM034）

271000 山东泰安，泰山医学院运动医学研究所

亓建洪，Email：jhqi7281@163.com

2017-10-17