揭秘生物昼夜节律的分子机制—— 2017诺贝尔生理或医学奖解读

王彦，滕花景，孙中生

揭秘生物昼夜节律的分子机制
—— 2017诺贝尔生理或医学奖解读

王彦，滕花景，孙中生

2017 年 10 月 2 日，诺贝尔奖评选委员会在瑞典首都斯德哥尔摩宣布，本届诺贝尔生理学或医学奖由美国的三位生物学家分享：布兰迪斯大学遗传学家杰弗里·霍尔（Jeffrey C. Hall）教授和同一大学的分子生物学家迈克尔·罗斯巴什（Michael M. Rosbash）教授，以及洛克菲勒大学的迈克尔·杨（Michael W. Young）教授，以表彰他们在揭示生物昼夜节律的分子机制方面做出的重大贡献。

霍尔 1945 年出生于美国纽约，1971 年在西雅图华盛顿大学获哲学博士学位，1971 - 1973 年在加州理工学院西蒙·本哲（Seymour Benzer）教授实验室从事博士后研究。1974 年就职于布兰迪斯大学。2002 年后到美国缅因大学任职直至 2012 年退休。霍尔教授致力于果蝇求偶行为和生物节律的神经生物学研究。

罗斯巴什 1944 年出生于美国堪萨斯城。他师从谢耳顿·彭曼（Sheldon Penman）教授，于 1970 年获得麻省理工大学生物物理学博士学位。而后在英国爱丁堡大学从事博士后研究。从 1974 年至今就职于布兰迪斯大学。罗斯巴什早期的工作主要集中在 mRNA 的代谢和加工，而后主要从事生物节律的研究。

杨 1949 年出生于美国迈阿密。1975 年，在德克萨斯大学获得遗传学博士学位。1975 - 1977 年在斯坦福大学医学院大卫·霍格内斯（Dave Hogness）实验室从事博士后研究，主要研究领域为 DNA 重组。从 1978 年开始在洛克菲勒大学任职，致力于果蝇觉醒和睡眠周期的遗传学研究。

1 昼夜节律分子机制的发现和证明是生命科学的一个重要进展

在自然界中，从单细胞的蓝藻到高等动植物均存在着一种以 24 h 左右为周期的、按照一定规律运行的生命活动，称之为昼夜节律。作为生命活动的基本特征之一，昼夜节律是由内源性“生物钟”驱动的，是生物在长期进化过程中形成的与自然环境变化相适应的内源性节律[1-2]。该生物钟既可以自激振荡，又可以接受环境周期变化的信号来调控自激振荡，使机体生命活动的昼夜节律与环境同步。生物钟可以精准地调节机体的生理机能，包括激素水平、睡眠需求、体温和新陈代谢等，保证机体的正常发育和生长。大量证据表明，当一个人的生活方式与内在生物钟节律长期不相符时，患多种疾病的风险会增加，如肥胖、糖尿病、高血压、高血脂和恶性肿瘤[3-8]。

对多种不同生命有机体的生物节律研究始于 20 世纪中期。如德国生物学家欧文·本林（Erwin Bunning）发现了植物叶闭合活动的节律行为[9-11]；德国医生和生物学家尤金·阿绍夫（Jürgen Aschoff）在大鼠、小鼠、鸟类、恒河猴等多个物种和人类中观察到了不同外环境刺激对生物节律行为的影响，并提出“倒班”制度对身心健康的可能危害[12-16]；美国生物学家科林·皮登觉（Colin Pittendrigh）研究了果蝇的生物节律行为[17]。本林、阿绍夫和皮登觉等的研究对生物节律存在的普遍性、基本特征和规律有了较为全面的描述和深入的了解，奠定了现代生物节律研究的基础，因此他们三人被尊称为“生物节律之父”。但他们当时的研究还无法从细胞和分子的水平阐明生物钟的组成元件和运行机制。

1971 年，本哲首先发现影响果蝇生物钟的基因突变，开启了生物钟的基因研究[18]。他们运用遗传学方法建立了果蝇的突变株，并观察这些果蝇的羽化节律。于 1971 年筛选到了三个突变果蝇品系，在节律周期上分别出现三个不同方向的改变（表型分别为“无节律”、“节律变长”和“节律变短”），并与同一个基因相关。他们将这一基因命名为“周期基因”（period，per），并在果蝇染色体中确定了per基因的位置，首次证明果蝇生物钟行为是受基因调控的。

1984 年，杨和罗斯巴什这两个研究团队分别克隆了果蝇per的 DNA 序列[19-22]，其长度约为 4.5 kb[20,23]。将编码per基因的 DNA 序列导入per突变果蝇，即可恢复其昼夜节律[20]。他们还进一步发现，per基因的 mRNA的表达水平呈现与昼夜同步的节律变化[24]，早晨水平较低，夜晚水平升高。per编码的蛋白 PER 位于细胞核中[25]，其水平也呈现类似的昼夜节律变化[26-27]。PER 蛋白受磷酸化调节，同时也受per表达水平的调节[28-29]。在生物钟变短的果蝇突变株per中，per的 mRNA 和 PER 蛋白水平的昼夜节律周期均显著变短[24,29]，提示per的基因转录的 mRNA 与翻译的 PER 蛋白存在负反馈调节。此研究为揭示“转录-翻译负反馈环路（transcription-translation feedback loop）”理论奠定了基础[24]。此外，罗斯巴什和杨团队还发现permRNA 与蛋白的昼夜节律之间有一定的间隔，也就是“相位”不同，PER 蛋白和permRNA 这种节律变化在“持续黑暗条件（constant darkness）”下依然存在[29]。

继per基因之后，其他生物钟基因也相继被克隆。1994年，杨实验室鉴定并克隆了果蝇的timeless基因（tim），还发现tim可以影响 PER 蛋白出入细胞核[30-32]。1998 年，罗斯巴什实验室在果蝇中发现了clock基因[33]；霍尔实验室发现了 chryptochrome（cry）基因参与果蝇生物钟[34]；霍尔和罗斯巴什团队合作发现了 cycle 基因（cyc）[35]等。

现在我们对以 24 h 为周期的果蝇生物钟的分子构成和运行机制已有了基本了解：在细胞核内，CLK 和 CYC蛋白（正向调节因子）形成异二聚体，通过结合per、tim和cry（负向调节因子）启动子区域的 E-box 元件，激活这些基因的转录；在细胞质内，PER、TIM 和 CRY 蛋白形成异二聚体后转移到核内，通过与正向调节因子结合而抑制负向调节因子本身的转录，进而形成转录-翻译负反馈环路[36]。

昼夜节律基因及其运行调控机制也同样存在于哺乳动物中。1994 年，美国西北大学的约瑟夫·高桥（Joseph Takahashi）发现了小鼠的生物钟clock基因（clk）[37]，并在 1997 年克隆了clk的 DNA 序列[38-39]。同年，美国贝勒医学院和日本东京大学的两个实验室在小鼠和人类基因组中分别发现和克隆了per基因[40-41]。

此外，美国约翰·霍普金斯大学的科特·瑞科特（Curt P. Richter）教授也对大鼠的生物钟行为做了多方面的深入研究，他们提出下丘脑的前端可能是哺乳动物生物钟的振荡器所在位置[42-43]。美国的伯克利加州大学的朱可（Irving Zucker）[44]和芝加哥大学的莫尔（Robert Moore）[45]发现了下丘脑前端的视交叉上核是启动大鼠生物钟的关键元件。日本东京大学的井上进一（Shin-Ichi Inouye）和川村宏（Hiroshi Kawamura）发现视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）神经细胞可能起调控和协调周围组织的生物钟保持同步运行的作用，从而被称为“主钟”（master clock）[46]。

2 我国科学家在该领域的贡献

我国科学家也为揭示生物钟运行的分子机制做出了重要贡献。他们中很多人在国外留学或工作期间参与了这一领域的重要工作。多名中国留学生参与了罗斯巴什实验室对果蝇生物钟的研究，如：俞强发现了果蝇 PER 蛋白缺失某一特定区段会影响其求偶时翅膀有节律地歌唱[47-48]；黄佐石发现 PER 可通过其 PAS 功能域与含有 bHLH-PAS 功能域的转录因子形成异二聚体，进而调节生物节律基因的转录[49]；刘欣发现了per基因的时空表达和 PER 蛋白的亚细胞定位[25,50]；曾红葵阐明了 PER-TIM 复合体在果蝇生物钟的调控作用[51]。

在哺乳类动物生物节律的研究中也有我国科学家的贡献。1997 年，在美国贝勒医学院从事博士后研究的孙中生等在克隆小鼠乳腺癌基因的过程中，发现一个基因与果蝇的生物钟基因per呈现高度的局部序列相似性，通过动物实验发现该基因的表达具有 24 小时的节律，且能随光周期的改变而变化。他们依据我国古老的授时装置——“日晷”，特地将该基因命名为 RIGUI[41]，随后该基因被正式命名为per1。此外，他们还在小鼠和人中发现了per基因的第二个同源基因per2。Per2 基因在昼夜节律的控制中枢——视交叉上核中的表达相对于per1 推迟 4 ～ 6 h，但与per1 一样具有昼夜节律基因的所有特性。为了确定per1、per2 基因在调节昼夜节律中的作用，他们通过基因敲除成功获得了per1-/-、per2-/-、per1/2 双敲除三种小鼠品系。在持续黑暗条件下，per1/2 双敲除小鼠完全丢失活动节律性。但在同样条件下，一些per2-/-小鼠的节律周期变短或丢失，而per1-/-小鼠节律周期则变长[52-53]。在成功克隆小鼠的生物钟基因以后，他们首次测定了人类外周血单核细胞（PBMCs）中per1、per2、per3 和DEC1 节律基因的表达模式，揭示了哺乳动物免疫生物钟的存在[54]，发现生物钟基因per2 参与调控免疫功能和内源的免疫应答[55]。此外，他们的研究还证明了机体内生物钟系统是疼痛节律性产生的物质基础，为临床痛症的时间生物学治疗奠定了理论基础[56]。但是转录组水平的研究发现仅有不到 20% 的基因的节律表达受转录-翻译负反馈环路调控。最近，他们与中南大学李家大教授的团队合作，通过整合近 5000 个哺乳动物昼夜节律相关的转录组和调控组数据，对 37 个人或小鼠的组织/细胞系、三种临床疾病的基因表达模式和调控因素进行了系统分析，开发了一个方便用户挖掘节律相关信息的平台—— CirGRD（http：// cirgrdb.biols.ac.cn/），为进一步揭示生物钟基因调节各种生理过程及疾病发生的分子机制奠定了基础[57]。

2001 年，当时在美国旧金山加州大学工作的傅颖慧等通过对一家族性睡眠相位提前综合征患者的家系进行遗传分析，发现家系中的一个含有hper2 编码的特定位点变异（对应于其蛋白质序列的 662 位丝氨酸）的成员，相位比一般人提前 4 小时，每天早上 4 点半醒，晚上 7 点半睡；凡是这个位点没有变异的成员，睡眠相位就正常[58]。2005年，当时在傅颖慧实验室工作，现执教于苏州大学的徐璎教授发现 CKIδ 基因突变也能导致人和小鼠相位提前[59]。现在北京生命科学研究所，当时在美国加州大学圣地亚哥分校从事博士后研究的张二荃首次运用 RNAi 技术筛选生物钟基因，找到了多个影响人类生物钟的基因[60]。中山大学的郭金虎教授于 2009 年在美国德克萨斯大学西南医学中心的刘一教授实验室从事博士后研究期间，发现了一条新的转录后负反馈回路能通过影响 mRNA 的稳定性来调节脉孢菌的昼夜节律[61]。

3 结语

随着生物钟基因的克隆及生物钟核心分子调控机制的发现，生物节律的研究重点已经转移到生物钟基因是如何在分子水平上调节各种生理过程及疾病的发生。生物钟调控环路不仅仅只影响其内部各节律基因的表达呈节律性变化，而且通过正向调控和负相调控机制的作用，进一步影响下游基因也呈现这种节律性的表达变化。转录组水平的证据表明，在各种不同的组织中，有 10% ～ 15% 的基因在 RNA 水平的表达具有节律性。这些下游基因在更多生理过程中承担着重要的调节作用，所以也使得哺乳动物体内的多种生理行为的变化呈现节律[62-66]。这些节律基因的表达是受多层次不同水平调控的，除了受经典的转录-翻译负反馈环路调控外，转录后调控如组蛋白修饰、染色质高级结构等在其节律表达中亦发挥了重要的作用。因此，在细胞-组织-器官-生物体的整体水平上解析生物钟的元件并揭示其调控机制，不仅对我们了解生命和生命活动具有重大的理论意义，而且将为治疗由于昼夜节律失常所引发的人类疾病提供有价值的线索[67-69]。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.009

国家自然科学基金（31200888）

100101 北京，中国科学院北京生命科学研究院

孙中生，Email：sunzs@biols.ac.cn

2017-10-23