聚合酶链反应检测麻风分枝杆菌的研究进展

刘 敏 郝明巨



聚合酶链反应检测麻风分枝杆菌的研究进展

刘 敏1郝明巨2

麻风的早期诊治对减少疾病传播、预防疾病进展和致残起重要作用。本文对PCR技术在检测麻风杆菌中的应用作一综述。

麻风； 麻风分枝杆菌； 聚合酶链反应

麻风杆菌在体外尚不能培养，常用的检测麻风菌的实验室方法是皮肤组织液刮片抗酸染色法(AFB)。AFB染色的方法敏感度很低，需要每克组织中至少含有104个细菌才能在显微镜下观察到[1]。PCR是一种高度敏感和特异的检测样本细菌DNA的方法，在过去30年里，已开发了多种用于麻风杆菌DNA的PCR检测方法，这些方法的应用对麻风的早期诊治和预防有重要意义。

1 PCR技术检测麻风分枝杆菌的实验室方法学研究进展

1.1 方法学进展 1989年，Hartskeerl等通过基因提取、扩增、识别等过程，检测麻风36kDa抗原编码基因，发现具有很高的灵敏度和特异性[2]。1990年，Williams等[3]基于探针杂交技术建立了一套检测感染样本中麻风菌DNA的PCR方法。同年，Plikaytis等运用巢式PCR的方法，采用两步法扩增麻风菌DNA片段，将灵敏度提高到了单个菌体的水平，缩短了检测时间[4]。单管PCR方法的运用避免了二次扩增的污染，简化了操作流程，而且提高了实验的灵敏度。2001年，Cole等[5]首先完成了麻风菌的全基因组测序，之后麻风菌的PCR检测得到了迅猛发展。实时定量PCR技术的应用，明显提高了检测的敏感度和特异性，大大缩短了检测时间，而且能够对细菌DNA进行直接定量，评估病人体内的细菌指数[6，7]。

1.2 检测的DNA目标片段 能够作为麻风菌DNA序列PCR扩增的靶基因有很多，包括18kDa、36kDa、65kDa等蛋白编码基因[4，8]、85抗原复合体(Ag85)基因[6]、sodA和16SrRNA[7]、多拷贝重复序列(RLEP)[9]、TTC重复序列[10]、HSP18 mRNA等[11]。由于重复序列存在于基因组DNA的多个部位，因此选择重复序列作为PCR的靶向DNA能够提高灵敏度，RLEP能够检测出10 fg含量的麻风菌DNA[12]。Martinez等运用定量PCR的方法比较了sodA、16SrRNA、RLEP和Ag85B对麻风的诊断价值，发现几种序列的特异性没有显著性差异，Ag85B、16SrRNA、sodA敏感度分别为66.1%、62.9%、59.7%，而RLEP敏感度最高为87.1%[13]。

Turankar等[14]对麻风病人的皮肤组织液切刮涂片、血液和病人周围环境中的土壤标本运用PCR的方法进行检测，比较了RLEP、rpoT、SodA和16SrRNA基因的敏感度的差异，同样发现RLEP基因的敏感度是最高的，分别能够检测出83%的皮肤切刮涂片标本、36%的土壤样本和所有血液阳性的标本，而且，在细菌指数BI阴性的麻风病人血液样本中仍有53%的阳性率。需要注意的是，RLEP基因高度保守，在其它分枝杆菌属也存在许多的同源序列，容易使实验结果出现假阳性[15]。最近的一项研究以麻风菌的4α萄聚糖转移酶基因(ML1545)作为靶点，与RLEP相比，具有非常高的灵敏度和特异性[16]。

1.3 检测样本类型 PCR不仅可以检测皮肤活检标本，还可以用于检测皮肤组织液切刮涂片、尿液、口腔和鼻腔拭子、毛囊、鼻腔分泌物、淋巴和血液等样本的检测[11，17-21]。皮肤活检样本可以预先经过石蜡包埋、福尔马林固定等处理后进行PCR检测，也可以将样本贮存于70%乙醇和FTA®洗脱卡中，甚至经过抗酸染色的推片也能够用于麻风的分子诊断[22-24]。这些标本非常利于样本的贮存和转运，便于样本的回顾性分析和转运至参考实验室进行诊断的确认。非侵入性标本在临床上易于获得，方便取材，对患者的创伤小，给麻风菌的检测带来便利，应用前景广阔，但目前来看，皮肤活检仍是一种应用最广泛和阳性检出率最高的样本。

近几年，有学者[14，25]在麻风高流行区开展麻风分子流行病学研究中，对麻风菌污染的土壤和水源进行了检测，检测到了麻风菌的DNA，为麻风流行病学传播提供了依据。

2 PCR技术检测麻风的临床应用

2.1 用于少菌型麻风的诊断 少菌型麻风由于皮损中麻风菌含量较少，临床上诊断较为困难。Martinez等通过PCR方法在79.2%的常规麻风菌检查为阴性的患者皮损中检测出麻风杆菌[6]，RLEP能够检测出73%的麻风菌指数(BI)为0的麻风病患者皮损内的麻风菌[13]。国内研究者运用RT-PCR的方法检测51例PB病人，38例呈阳性，敏感度达到了8 fg。一项回顾性研究中，检测了一组既往诊断为皮肤病的麻风菌的不同基因(Ag85B、sodA、16S rRNA和RLEP)[7]，当包含大量少菌样本(单一皮损和结核样型麻风)时，虽然敏感度有所下降，但仍有50%。由此可见，PCR反应的高灵敏度和特异性非常有助于早期麻风或少菌型麻风的诊断。

2.2 用于单纯神经炎性麻风(PNL)的诊断 PNL表现为皮肤麻痹或感觉丧失，皮损区域内神经肿大，但无肉眼可见的皮损。病人往往镜检和组织学检查阴性，没有典型的皮肤损害，很容易被漏诊。Bezerra等研究者通过PCR的方法发现，约1/3神经活检抗酸染色检查阴性的PNL病人，能够检测到麻风菌[26]。Jardim等证实，PCR对于PNL病例的诊断优于抗PGL-I抗体和抗酸染色镜检[27]，因此，PCR为PNL提供了一种高灵敏度的诊断方法。

2.3 用于麻风的治疗监测 PCR不仅用于麻风的诊断，而且能够评估病菌载量，有助于疾病的治疗监测。Santos等[21]利用RLEP法PCR检测了麻风病人的毛发球囊，血清、鼻腔分泌物、淋巴和皮肤活检样本，发现在MDT治疗长达8年以后，以上临床样本中，至少有一项PCR检测为阳性的病人所占的比例仍有54.5%。因此，这种基于DNA的PCR分析容易引起“临床假阳性”，不能真实的反应治疗效果。鉴于此，一些研究通过逆转录PCR技术来评估麻风菌载量。基于对代表活菌标志的16S rRNA的基因表达分析，温艳等[28]运用RT-PCR方法扩增14例麻风患者治疗前、中、后皮损组织麻风菌16S rRNA，发现麻风活菌量随治疗时间的延长也随之下降。然而，Phetsuksiri等[29]发现在MDT治疗6个月后，虽然PB病人的阳性率下降为4%，仍有44%的多菌型(MB)病人能够检测到16S rRNA。

由于16S rRNA相对稳定，同时也是一种管家基因，缺乏靶基因来对模板进行标准化以用于麻风菌定量检测，为解决上述问题，Martinez等[7]提出一项基于RNA/DNA比值的实时定量PCR技术，利用麻风菌特异性RNA相对于总DNA的降低以评估治疗效果。体外实验表明，在利福平作用后的48小时就有比值的降低，病人活检样本证实了MDT治疗与基因表达水平的相关性，这种方法可以对麻风病人治疗和耐药监测进行随访[30]。Lini等[11]分别检测麻风菌DNA和HSP 18mRNA来观察麻风疗效，他们检测了47例麻风患者中石蜡包埋样本中麻风菌DNA和mRNA拷贝数，在经历了2年的MDT治疗后，虽然仍能在皮损部位检测到麻风菌DNA，但已经检测不到HSP18mRNA。由此可见，基于RNA的PCR检测也有助于评价麻风治疗效果。

2.4 用于麻风菌耐药基因的检测 麻风菌耐药对麻风化学治疗带来严峻挑战，对利福平耐药菌株是由编码细菌RNA聚合酶β亚单位的rpoB基因发生突变所致。2001年，Honoré等[31]通过PCR扩增和一系列寡核苷酸探针进行杂交，检测出对利福平(RFP)耐药麻风菌株。王红斌等利用Q-solution作为PCR反应增效剂，巢式PCR提高PCR敏感性，快速、高效地扩增出RFP耐药的rpoB基因片段，再通过测序检测出麻风菌对RFP的耐药基因[32]。除了能够检测出对利福平耐药的rpoB基因突变，有研究者利用PCR扩增后对基因产物进行测序或者一种新的“实时定量PCR-高分辨熔解分析(RT-PCR-HRM)”技术，能够检测出对氨苯砜和氧氟沙星等喹诺酮类药物耐药分别相关的folP1、gyrA基因突变[33,34]。因此，PCR对于检测麻风杆菌耐药基因，进而选择合适的抗菌药物，对病人进行个体化治疗发挥不可替代的作用。

2.5 用于麻风密切接触者的发病监测 对家庭密切接触者的监测和随访是防控麻风的重要环节，通过PCR技术能够早期发现麻风菌的感染。麻风菌主要通过飞沫传播，因此许多研究以鼻腔拭子作为样本，通过PCR方法检测家庭接触者的麻风菌DNA。值得注意的是，大约1%～10%的家庭密切接触者鼻腔拭子中能检测出麻风菌DNA，但是并不代表这些阳性个体最终会发病[35]，如此高的阳性率对PCR监测密切人群带来疑问。有研究显示PGL-I试验阳性的密切接触者发病的风险较大[36]，因此有研究者建议将PCR与PGL-I联合测定用于识别家庭密切者的亚临床感染，提前用药进行预防[37]。PCR对于监测麻风密切接触者的意义值得进一步研究。

2.6 用于麻风流行病学传播的研究 环境因素对于麻风菌的传播得到越来越多的重视。利用PCR检测麻风菌污染的土壤和水源有助于分析传染源，为麻风流行病学传播提供依据。Lavania等采用PCR扩增麻风菌16S rRNA发现，在麻风流行区土壤中有55%的样本呈阳性，而在非麻风流行区仅有15%阳性率。Turankar等[25]利用PCR扩增土壤中麻风菌特异性RLEP(129 bp)，并运用单核苷酸多态性(SNP)和DNA测序分析其亚型，结果表明，52份土壤样本有17例呈阳性，亚型分析表明土壤中的麻风菌与病人和密切接触者均来自于同一感染源。邢燕等运用巢式PCR扩增麻风菌特异性RLEP并对产物进行测序的方法，检测了70份麻风流行区的水和土壤样本，有36份PCR呈阳性，经测序确认有21份含麻风杆菌，确认率达58%。由此可见，麻风病流行村庄的水、土壤中的麻风杆菌可能是麻风病的传染源。环境中麻风菌的存在对于麻风流行病学中的意义有待进一步研究。

3 结语

PCR的特异性好，敏感度高，操作简便、快速，尤其是实时定量PCR技术的应用，大大缩短了检测时间，而且能够对细菌DNA或RNA进行直接定量，评估病人体内的麻风菌指数进行临床分型。RNA水平的定量对于监测麻风疗效有着良好的效果。PCR与PGL-I联合联合测定有助于识别家庭密切者的亚临床感染。但应注意的是，目前报道中对麻风杆菌检测的目的基因或片段多不一致，检测方法也多种多样，各实验室报道的敏感度、特异性变异均较大，对各个实验室麻风菌DNA检测的评价体系有待完善。而且，PCR对技术要求较高，需较复杂的实验设备及技术支持。不同核酸提取方法、污染物的控制等实验条件，以及实验室工作人员水平都会对检测结果带来影响。临床实验室必须充分了解 PCR测定的不确定性，并且采取相应质控措施，才能确保试验结果的准确性。

同时我们也应该看到，PCR方法检测麻风杆菌虽然敏感，但对麻风的诊断仍有局限性，主要原因在于麻风作为一个慢性传染病，亚临床感染以及临床带菌现象比较常见，即使常规组织液查菌检查到抗酸杆菌，在没有临床表现时，也无法诊断麻风。总之，PCR对于麻风疑难病例如早期PB和PNL的诊断、化学药物治疗评估、耐药性监测和密切接触者的监测等提供了新的技术，随着多种PCR技术的开发和更多敏感、特异的基因用于麻风检测，PCR检测麻风杆菌的方法将会得到越来越广泛的应用。

[1] Shepard CC, McRae DH. A method for counting acid-fast bacteria[J]. Int J Lepr Other Mycobact Dis,1967,36(1):78-82.

[2] Hartskeerl RA, De Wit MYL, Klatser PR. Polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae[J].Microbiology,1989,135(9):2357-2364.

[3] Williams DL, Gillis TP, Booth RJ, et al. The use of a specific DNA probe and polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae[J]. J Infect Dis,1990,162(1):193-200.

[4] Plikaytis BB, Gelber RH, Shinnick TM. Rapid and sensitive detection of Mycobacterium leprae using a nested-primer gene amplification assay[J]. J Clin Microbiol,1990,28(9):1913-1917.

[5] Cole ST, Eiglmeier K, Parkhill J, et al. Massive gene decay in the leprosy bacillus[J]. Nature,2001,409(6823):1007-1011.

[6] Martinez AN, Britto CF, Nery JA, et al. Evaluation of real-time and conventional PCR targeting complex 85 genes for detection of Mycobacterium leprae DNA in skin biopsy samples from patients diagnosed with leprosy[J]. J Clin Microbiol,2006,44(9):3154-3159.

[7] Martinez AN, Lahiri R, Pittman TL, et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR[J]. J Clin Microbiol,2009,47(7):2124-2130.

[8] Scollard DM, Gillis TP, Williams DL. Polymerase chain reaction assay for the detection and identification of Mycobacterium leprae in patients in the United States[J]. Am J ClinPathol,1998,109(5):642-646.

[9] Adams LB, Pena MT, Sharma R, et al. Insights from animal models on the immunogenetics of leprosy: a review[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz,2012,107(Suppl 1):197-208.

[10] Shin YC, Lee H, Lee H, et al. Variable numbers of TTC repeats in Mycobacterium leprae DNA from leprosy patients and use in strain differentiation[J]. J Clin Microbiol,2000,38(12):4535-4538.

[11] Lini N, Shankernarayan NP, Dharmalingam K. Quantitative real-time PCR analysis of Mycobacterium leprae DNA and mRNA in human biopsy material from leprosy and reactional cases[J]. J Med Microbiol,2009,58(Pt 6):753-759.

[12] Donoghue HD, Holton J, Spigelman M. PCR primers that can detect low levels of Mycobacterium leprae DNA[J]. J Med Microbiol,2001,50(2):177-182.

[13] Martinez AN, Ribeiro-Alves M, Sarno EN, et al. Evaluation of qPCR-based assays for leprosy diagnosis directly in clinical specimens[J]. PLoS Negl Trop Dis,2011,5(10):e1354.

[14] Turankar RP, Pandey S, Lavania M, et al. Comparative evaluation of PCR amplification of RLEP, 16S rRNA, rpoT and Sod A gene targets for detection of M. leprae DNA from clinical and environmental samples[J]. Int J Mycobacteriol,2015,4(1):54-59.

[15] Kent L, McHugh TD, Billington O, et al. Demonstration of homology between IS6110 of Mycobacterium tuberculosis and DNAs of other Mycobacterium spp[J]. J Clin Microbiol,1995,33(9):2290-2293.

[16] Chaitanya VS, Das M, Eisenbach TL, et al. Mycobacterium leprae specific genomic target in the promoter region of probable 4-alpha-glucanotransferase (ML1545) gene with potential sensitivity for polymerase chain reaction based diagnosis of leprosy[J]. International J Mycobacteriology,2016,5(2):135-141.

[17] Caleffi KR, Hirata RD, Hirata MH, et al. Use of the polymerase chain reaction to detect Mycobacterium leprae in urine[J]. Braz J Med Biol Res,2012,45(2):153-157.

[18] Almeida EC, Martinez AN, Maniero VC, et al. Detection of Mycobacterium leprae DNA by polymerase chain reaction in the blood and nasal secretion of Brazilian household contacts[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz,2004,99(5):509-511.

[19] Rosa FB, Souza VC, Almeida TA, et al. Detection of Mycobacterium leprae in saliva and the evaluation of oral sensitivity in patients with leprosy[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz,2013,108(5):572-577.

[20] Santos AR, De Miranda AB, Sarno EN, et al. Use of PCR-mediated amplification of Mycobacterium leprae DNA in different types of clinical samples for the diagnosis of leprosy[J]. J Med Microbiol,1993,39(4):298-304.

[21] Santos AR, Balassiano V, Oliveira ML, et al. Detection of Mycobacterium leprae DNA by polymerase chain reaction in the blood of individuals, eight years after completion of anti-leprosy therapy[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz,2001,96(8):1129-1133.

[22] Morgado de Abreu MAM, Roselino AM, Enokihara M, et al. Mycobacterium leprae is identified in the oral mucosa from paucibacillary and multibacillary leprosy patients[J]. Clinical Microbiology Infection,2014,20(1):59-64.

[23] Aye KS, Matsuoka M, Kai M, et al. FTA card utility for PCR detection of Mycobacterium leprae[J]. Jpn J Infect Dis,2011,64(3):246-248.

[24] Ruiz-Fuentes JL, Diaz A, Entenza AE, et al. Comparison of four DNA extraction methods for the detection of Mycobacterium leprae from Ziehl-Neelsen-stained microscopic slides[J]. Int J Mycobacteriol,2015,4(4):284-289.

[25] Turankar RP, Lavania M, Chaitanya VS, et al. Single nucleotide polymorphism-based molecular typing of M. leprae from multicase families of leprosy patients and their surroundings to understand the transmission of leprosy[J]. Clin Microbiol Infect,2014,20(3):142-149.

[26] Bezerra Da, Cunha FM, Werneck MC, et al. Pure neural leprosy: diagnostic value of the polymerase chain reaction[J]. Muscle Nerve,2006,33(3):409-414.

[27] Jardim MR, Antunes SL, Simons B, et al. Role of PGL-I antibody detection in the diagnosis of pure neural leprosy[J]. Lepr Rev,2005,76(3):232-240.

[28] 温艳,刘健,陈小华,等.RT-PCR方法扩增麻风菌16S rRNA在麻风疗效考核中的价值[J].热带医学杂志,2010,10(11):1285-1288.

[29] Phetsuksiri B, Rudeeaneksin J, Supapkul P, et al. A simplified reverse transcriptase PCR for rapid detection of Mycobacterium leprae in skin specimens[J]. FEMS Immunol Med Microbiol,2006,48(3):319-328.

[30] Davis GL, Ray NA, Lahiri R, et al. Molecular assays for determining Mycobacterium leprae viability in tissues of experimentally infected mice[J]. PLoS Negl Trop Dis,2013,7(8):e2404.

[31] Honore N, Roche PW, Grosset JH, et al. A method for rapid detection of rifampicin-resistant isolates of Mycobacterium leprae[J]. Lepr Rev,2001,72(4):441-448.

[32] 王红斌,翁小满,温艳,等.巢式聚合酶链反应检测麻风菌利福平耐药基因的研究[J].中华检验医学杂志,2005,28(10):1015-1017.

[33] Li W, Matsuoka M, Kai M, et al. Real-time PCR and high-resolution melt analysis for rapid detection of Mycobacterium leprae drug resistance mutations and strain types[J]. J Clin Microbiol,2012,50(3):742-753.

[34] Sekar B, Arunagiri K, Kumar BN, et al. Detection of mutations in folp1, rpoB and gyrA genes of M. leprae by PCR- direct sequencing--a rapid tool for screening drug resistance in leprosy[J]. Lepr Rev,2011,82(1):36-45.

[35] Martinez AN, Talhari C, Moraes MO, et al. PCR-based techniques for leprosy diagnosis: from the laboratory to the clinic[J]. PLoS Negl Trop Dis,2014,8(4):e2655.

[36] Hacker MA, Sales AM, Illarramendi X, et al. A profile of patients treated at a national leprosy outpatient referral clinic in Rio de Janeiro, Brazil, 1986-2007[J]. Rev Panam Salud Publica,2012,31(6):485-491.

[37] Araujo S, Lobato J, Reis Ede M, et al. Unveiling healthy carriers and subclinical infections among household contacts of leprosy patients who play potential roles in the disease chain of transmission[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz,2012,107(Suppl 1):55-59.

(收稿：2016-04-20 修回：2016-11-19)

Update of polymerase chain reaction in the detection of mycobacterium leprae

LIUMin1,HAOMingju2.

1.DepartmentofClinicalLaboratory,JinanDermatosisPreventionandControlHospital,Jinan250001,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,QianfoMountainHospitalofShandongUniversity,Jinan250014,China.

HAOMingju,E-mail:haomingju@163.com

Earlier diagnosis and treatment of leprosy is of great importance in reducing spread of leprosy and preventing progression of disease and disability. This article summarizes the use of PCR techniques to detect Mycobacterium leprae.

leprosy; Mycobacterium leprae; polymerase chain reaction

1济南市皮肤病防治院检验科，济南，250001 2山东省千佛山医院检验科，济南，250014

郝明巨，E-mail: haomingju@163.com