周期疗法对乳腺增生病模型大鼠ER、PR、ERK的影响

钱小玲

（广西医科大学中西医结合临床系 广西南宁 530021）

周期疗法对乳腺增生病模型大鼠ER、PR、ERK的影响

钱小玲

（广西医科大学中西医结合临床系 广西南宁 530021）

目的探讨周期疗法经验方对乳腺增生病模型大鼠ER、PR、ERK表达的影响。方法从90只大鼠随机分为空白组、模型组、逍遥丸组、三苯氧胺组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，除空白组外其余各组均进行乳腺增生造模。待造模成功后，空白组和模型组给生理盐水0.2ml/kg·d灌胃，其余5组分别给与逍遥丸、三苯氧胺、中药（Ⅰ号方、Ⅱ号方）灌胃，共30天。结果造模后，各造模组大鼠的乳头直径与空白组比较有差异有统计学意义（P＜0.05）。灌服Ⅰ号方后各用药组大鼠乳头直径缩小，但仍大于空白组（P＜0.05）。灌服Ⅱ号方后大鼠的乳头直径进一步缩小，各用药组小于模型组（P＜0.05），除中药高剂量组外余各组大于空白组（P＜0.05）；各组ER、PR、ERK积分与模型组相比较均较低（P＜0.05），中药高剂量组ERK积分低于三苯氧胺组（P＜0.05）。结论中药周期疗法经验方可使乳腺增生模型大鼠增生乳头缩小，ER、PR、ERK积分降低。

乳腺增生病；周期疗法；ER；PR；ERK

我们在长期的医疗实践中积累了丰富的治疗乳腺增生病经验，在临床上尤其擅长用疏肝散结、补肾柔肝周期疗法治疗乳腺增生病［1-2］，为了探讨治疗乳腺增生病经验方的作用机制，特进行了本次实验。

1 实验材料

1.1 实验动物 选取SPF级3～4月龄、健康雌性SD大鼠90只，体重200±20g，由广西医科大学动物实验中心SPF级实验室提供，批号为 SXXK（陕）2015-0431-820010054。

1.2 主要试剂、药品 苯甲酸雌二醇注射液（杭州动物药品厂，批号：140429）、生理盐水（辰欣药业股份有限公司，批号：1206191101）、黄体酮注射液（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：130702）、三苯氧胺（扬子江药业集团有限公司，批号：14042911）、逍遥丸（兰州佛慈制药股份有限公司，批号：14A28）、中药（I号方组成：柴胡、赤芍、枳实、川楝子、夏枯草、白蒺藜、全瓜蒌、鳖甲、王不留行、当归、生地、海藻、昆布。II号方组成：柴胡、醋香附、元胡、王不留行、川楝子、夏枯草、当归、杭白芍、海藻、昆布、何首乌、菟丝子、肉苁蓉、巴戟天、知母、黄柏）。以上药物均购自陕西中医药大学附属医院药剂科。兔抗鼠ERK抗体（编号：ZS-940，批号：G0110）、兔抗鼠ER抗体（编号：ZS-5420，批号：23546）、兔抗鼠PR抗体（编号：ZS-5380，批号：23546）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 实验方法

从90只大鼠中随机抽取20只，为空白组，右下肢肌肉注射生理盐水注射液，剂量为0.2ml/kg·d，共30天。其余70只大鼠进行造模【3-4】：大鼠右下肢每日肌注苯甲酸雌二醇注射液，剂量为0.5mg/kg·d，25天后，改为肌注射黄体酮注射液，剂量为4.5mg/kg·d，共5天。实验第31天随机从造模组和空白组分别抽取10只大鼠，脱臼处死大鼠后，无菌操作剜下其第3对的左侧乳房，置于10%的甲醛溶液中固定，包埋切片，HE染色后在光镜下观察组织的形态学变化，观测造模是否成功。待造模成功后将余60只大鼠按灌服药物不同随机分为6组，每组10只，分别为模型组、逍遥丸组、三苯氧胺组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组。空白组和模型组给生理盐水0.2ml/kg·d灌胃，其余5组采用灌胃方式给药，药物剂量根据人与动物每公斤体重剂量换算系数表换算。其中逍遥丸组灌服逍遥丸混悬液0.8g/kg·d；TAM组灌服三苯氧胺水溶剂3.6mg/kg·d；中药组先灌服I号方10天，低、中、高剂量组分别为11.1g/kg·d、22.2g/kg·d、44.4g/kg·d，后灌服Ⅱ号方20天，低、中、高剂量组分别为9.6g/kg·d、19.2g/kg·d、38.4g/kg·d。

分别于造模后、灌服Ⅰ号方10天后、灌服Ⅱ号方20天后，测量大鼠第3对乳房左侧乳头的直径。末次灌胃24小时后，脱臼处死大鼠后，无菌操作楔形取下大鼠第3对左侧乳房，用10%的中性甲醛溶液固定后分别进行病理切片及免疫组化法检测 ER、PR、ERK阳性表达。免疫组化法检测 ER、PR、ERK阳性表达的判断标准［3］：乳腺的导管及小叶上皮细胞的核和/或胞浆呈现棕黄色着色时判为阳性。未见阳性细胞表达计为（-）；阳性细胞数小于总数的20%，而局部见少量较强着色的阳性细胞计为（±）；若阳性细胞率大于20%，依据阳性细胞的数目由少到多、着色由浅到深依次计为（+）、（++）、（+++）、（++++）。若计算其阳性率则将（±）同时计入阳性范围；（-）、（±）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。分别计为 0、1、2、3、4、5分，其积分值愈高，则ER、PR、ERK含量越高。

试验期间所有实验动物分笼饲养，室温24℃～27℃，相对湿度为49%～61%，通风良好，标准饲料，自由进食饮水。

3 统计学方法

数据采用SPSS17.0统计软件处理，所有数据均采用均数±标准差（±s）表示，各指标组间采用单因素方差分析。［5-6］

4 结果

4.1 一般情况 与空白组大鼠相比，于造模第12日起，其余各组大鼠开始出现喜聚集、毛发粗糙、具有攻击性、乳房色红，造模结束后出现精神不振、爪凉、易激惹、乳房色红、透毛可见；用药后呈现有不同程度的好转，活动增加，易激惹、乳房红肿现象基本消失。除空白组外，其余各组间表现无明显差异。

4.2 用药前后乳头直径的变化

表1 乳头直径变化（±s）

表1 乳头直径变化（±s）

注：#与空白组比较P＜0.05；*与模型组比较P＜0.05。

灌服Ⅱ方后乳头直径（mm）0.92±0.09* 1.33±0.13#1.10±0.08#* 1.14±0.15#* 1.09±0.11#* 1.04±0.08#* 0.90±0.09*组别 例数空白组模型组三苯氧胺组逍遥丸组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组10 10 10 10 10 10 10造模后乳头直径（mm）0.83±0.13* 1.67±0.15#1.65±0.18#1.67±0.13#1.59±0.12#1.65±0.22#1.58±0.17#灌服Ⅰ方后乳头直径（mm）0.98±0.14* 1.32±0.13#1.28±0.09#1.36±0.20#1.20±0.16#1.22±0.16#1.26±0.20#

在造模后，各造模组大鼠的乳头直径与空白组比较有差异有统计学意义（P＜0.05），各造模组间差异差异无统计学意义（P＞0.05）；灌服Ⅰ号方10天后各用药组大鼠乳头直径缩小，但与空白组比较仍有统计学差异（P＜0.05），各造模组间无明显差异（P＞0.05）；灌服Ⅱ号方20天后大鼠的乳头直径进一步缩小，除中药高剂量组外，其余各造模组与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而各用药组与模型组比较有差异有统计学意义（P＜0.05）。说明造模后大鼠乳头直径增大，用药可使增大的乳头缩小，尤其是在序贯应用Ⅰ号方、Ⅱ号方，其中又以中药高剂量组作用最明显（与空白组比较P＞0.05）。

4.3 乳腺组织ER、PR、ERK的表达强度

4.3.1 乳腺组织ER、PR的表达强度

表4 ER、PR表达积分（±s）

表4 ER、PR表达积分（±s）

注：*与模型组比较P＜0.05

P R组别n E R空白组模型组三苯氧胺组逍遥丸组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组1 . 8 0 ± 0 . 8 4 * 4 . 0 0 ± 1 . 0 0 2 . 2 0 ± 1 . 3 0 * 2 . 4 0 ± 0 . 5 5 * 1 . 6 0 ± 1 . 3 4 * 1 . 8 0 ± 0 . 8 4 * 1 . 6 0 ± 0 . 5 5 * 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 . 2 0 ± 0 . 8 3 * 4 . 0 0 ± 1 . 0 0 2 . 0 0 ± 1 . 2 2 2 . 4 0 ± 0 . 5 5 1 . 8 0 ± 1 . 6 4 1 . 2 0 ± 0 . 4 5 * 2 . 6 0 ± 1 . 8 1

各组大鼠乳腺ER表达积分与模型组相比较均较低，其中以空白组、中药中剂量组较明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余各组间相比较差异无统计学意义。说明造模后大鼠乳腺ER表达增强，而使用逍遥丸、三苯氧胺及中药后可使ER表达减轻，其中以中药中剂量组效果最明显。

各组大鼠乳腺PR表达积分与模型组相比较也较低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其余各组间比较差异无统计学意义。说明造模后大鼠乳腺PR表达增强，逍遥丸、三苯氧胺、中药各组均可降低乳腺增生病模型大鼠乳腺PR的表达。

4.3.2 乳腺组织ERK的表达强度的变化

表5 ERK积分值（±s）

表5 ERK积分值（±s）

注：*与模型组比较P＜0.05；△与三苯氧胺组比较P＜0.05。

ERK 1.90±0.74*3.60±1.17 2.80±0.79 2.60±0.84 2.10±0.99 2.30±0.48 1.90±0.99*△组别空白组模型组三苯氧胺组逍遥丸组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组N 10 10 10 10 10 10 10

与模型组相比较，各组大鼠乳腺ERK表达积分均较低，其中以空白组、中药高剂量组较明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。与三苯氧胺组相比较，中药高剂量组ERK表达积分较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。其余各组间比较，差异无统计学意义。说明造模后大鼠乳腺ERK表达增强，用药可使其表达减轻，其中以中药高剂量组最为明显，且中药高剂量组的作用较三苯氧胺组明显。

5 讨论

乳腺增生病（Hyperplasin of Mammary Gland，HMG）是一种非炎非瘤的增生性病变，与内分泌紊乱关系密切，其基本病理变化是乳腺的腺泡、导管及纤维结缔组织的增生［4］。HMG的发病可以是从青春期至绝经期的任一年龄，其中以25～45岁为多见，35～45岁为高峰年龄，约占全部乳腺疾病的70%以上。中医称其为“乳癖”，冲任失调、肝郁肾虚为其发病之本，血瘀气滞痰凝为其发病之标，病属本虚标实，与肝脾肾三脏［5］密切相关，其症状常在月经前明显加重。

在临床诊疗中，武权生教授依据月经节律中冲任、胞宫气血由满盈、溢泻至空虚的变化和本病有随月经周期发作的特点而分段周期论治。强调“经前勿补，经后勿泻”的原则，认为经前血海充盈，宜予疏导；经后血海空虚，宜予调补。临床治疗遵循此规律周期治疗疾病，经前治标，经后固本，常见显效。因此，针对乳腺增生病在月经的不同时期制定了不同的中药处方：

I号方重用柴胡疏肝解郁，枳实理气解郁，泄热破结，二者共为君药，疏肝散结为主，一升一降，加强舒畅肝气之功，肝气舒，结块散，乳痛则消。川楝子能理气而止痛，白蒺藜可疏肝解郁，二药相伍，疏肝解郁和胃；鳖甲、昆布、海藻软坚散结，以上共为臣药，疏肝解郁，软坚散结。当归、王不留行活血消肿；夏枯草、全瓜蒌散结消肿亦可清热，共为佐使，活血、清热、消肿。诸药合用，共奏疏肝清热、软坚散结之效。II号方中菟丝子、巴戟天、肉苁蓉补肾阳亦能调补冲任，三者共为君药，肾气健，肝气平，则冲任调。白芍可预防长期用药耗阴并调冲；当归甘温而润、养血活血，白芍配当归活血调经、养阴柔肝；柴胡、醋香附、川楝子疏肝解郁；知母、黄柏滋肾阴，以上共为臣药，补肾柔肝，又肝肾同源，肾气肾精充足则肝主疏泄的功能得以更好的发挥。海藻、昆布、夏枯草散结消肿；何首乌补益精血，配夏枯草可散结消肿；元胡活血化瘀、理气止痛；王不留行活血通经，行血脉，共为佐使，散结消肿，活血止痛。全方共奏疏肝、补肾柔肝、调补冲任之效。两方紧紧抓住HMG肝气郁结、痰凝血瘀、冲任失调的病机，配伍精当，根据HMG的病理特点，攻补兼施，标本兼治而不失侧重，做到病愈而不易复发。

妇女正常乳腺中的雌、孕激素受体高表达与乳腺癌的发病率升高有关［7-10］，更有学者通过实验发现乳腺组织从正常到增生终至癌变的过程中，ER的阳性表达量呈渐进性［7］。ERK2mRNA［8］在乳腺病中表达由强到弱分别为乳腺癌、非典型增生、良性增生、正常乳腺，说明ERK2在乳腺癌发生整个过程中为活化状态，与乳腺增生的发病有关。本研究表明：乳腺增生大鼠ER、PR、ERK含量明显升高，而周期治疗可抑制雌、孕激素受体的表达，减弱对雌孕激素对靶细胞的敏感性，从而达到治疗乳腺增生的目的。

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R305

A

2095-9923（2016）-04

广西教育厅资助项目（015JK271）;广西中医药管理局基金项目（2015018）