5-羟基川陈皮素对肿瘤细胞糖胺聚糖含量和结构的影响*

崔怡迪， 唐 洋， 韩章润， 曾 璇， 徐玲玲， 张丽娟， 邱培菊

(中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室，山东省糖科学与糖工程重点实验室，山东 青岛 266003)

5-羟基川陈皮素对肿瘤细胞糖胺聚糖含量和结构的影响*

崔怡迪， 唐 洋， 韩章润， 曾 璇， 徐玲玲， 张丽娟， 邱培菊**

(中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室，山东省糖科学与糖工程重点实验室，山东 青岛 266003)

糖胺聚糖(GAGs)位于细胞膜及胞外基质，它通过与多种生长因子受体结合来介导细胞内的信号转导，进而调控细胞的增殖与分化。研究表明，GAGs结构或含量变化在肿瘤发生和发展中发挥了重要作用。黄酮类化合物可影响肿瘤细胞表面GAGs合成，前期研究发现，5-羟基川陈皮素(5HPMF)可通过干预细胞内多种信号通路进而抑制肺癌和结肠癌细胞增殖，然而，5HPMF如何影响GAGs结构和含量的变化进而介导信号转导通路的机制还不清楚。基于此，本研究利用BaF3细胞模型，流式细胞仪及HPLC技术，首次探讨了5HPMF对肺癌和结肠癌细胞GAGs含量和结构的影响。结果表明，来源于HT29和A549细胞的GAGs可增强FGF1介导的BaF3细胞生长而5HPMF(10 μmol·L-1)则显著地抑制其生长作用，且5HPMF可显著地降低HCT116和A549细胞表面FGF2或FGF8介导的GAGs·FGF·FGFR三元复合物的荧光强度，但是5HPMF对GAGs中葡萄糖胺和半乳糖胺的含量及两者比例无明显影响，由此可推断5HPMF可能通过影响肺癌和结肠癌细胞表面GAGs结构而介导细胞内部信号转导。本研究为进一步探讨5HPMF对肺癌和结肠癌细胞表面GAGs二糖结构的变化与活性之间的相关性奠定了实验基础。

糖胺聚糖；5-羟基川陈皮素；荧光强度；FGF；FGFR

生物体内糖胺聚糖(GAGs)根据不同的二糖重复单元分为两大类：即硫酸软骨素(乙酰半乳糖胺-糖醛酸)和硫酸乙酰肝素(乙酰葡萄糖胺-糖醛酸)。根据二糖重复单元硫酸修饰部位的不同，硫酸软骨素(CS)又可分为CS-A，CS-B，CS-C，CS-D和CS-E。肥大细胞产生硫酸化修饰程度最高的硫酸乙酰肝素(HS)被称之为肝素(HP)。

糖胺聚糖(GAGs)位于细胞膜及胞外基质，它可与多种生长因子受体结合，介导细胞内的信号转导，进而调控细胞的增殖与分化。GAGs组成和含量的变化在肿瘤发生、发展和转移过程中发挥了重要作用，如诱导正常细胞变为肿瘤细胞[1-2]，调节肿瘤生长、侵润[3]，促进肿瘤新血管生成[4]，促使肿瘤发生转移[5-6]。研究发现，无论原发性还是转移性肿瘤，瘤组织及病人血液中GAGs含量普遍增高，并伴有GAGs结构的变化，这在结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌中均得到证实[7-17]。与此同时，GAGs可通过调节成纤维细胞因子(FGFs)活性介导重要的细胞过程，动力学实验表明两分子FGFs首先结合到膜嵌合蛋白聚糖(HSPGs)的HS链上，进一步招募两分子FGFRs共同组成FGF·GAGs·FGFRs三元信号复合物，进而介导细胞内部信号转导。目前，FGF的过表达、多态性、异位表达及其受体阻断与很多人类肿瘤的关系已被报道，如骨髓瘤、乳腺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌和宫颈癌等[18-19]。

黄酮类化合物可影响GAGs合成[20-23]。5-羟基川陈皮素(5HPMF)是从橘子皮中分离得到的一种结构新颖的多甲氧基黄酮类化合物，前期研究表明5HPMF可显著地抑制结肠癌和肺癌细胞增殖、诱导细胞周期滞留、促进细胞凋亡，并对结肠癌和肺癌细胞内多种信号转导途径有调节作用[24-28]，目前关于5HPMF对肿瘤细胞表面GAGs含量或结构的影响未见报道。基于此，本研究将利用BaF3细胞模型，流式细胞仪及HPLC技术，探讨5HPMF对肺癌和结肠癌细胞GAGs含量和结构的影响。本研究将为进一步探讨5HPMF对肿瘤细胞GAGs的影响与其抗肿瘤细胞增殖作用的相关性实验基础。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

A549人肺癌细胞和HCT116人结肠癌细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。两种细胞分别培养在含有5%FBS、0.1mg/mL链霉素、100U/mL青霉素的F-12和Mycoy’s 5A培养基，于37℃，5%CO2培养条件下生长。实验过程中所用肿瘤细胞均为3-30代，细胞形态正常。DMSO作为溶解药物的溶剂，终浓度为0.1%。

1.2 细胞毒性实验

为保证每组GAGs样品来自同等数量的肿瘤细胞，细胞数校正方法如下：分别取对数生长期HCT116细胞和A549细胞，调整细胞浓度为4×104个/mL，接种于6孔板，每孔加入2mL培养基，于37℃，5%CO2条件下孵育24 h。吸去培养基，空白对照组加入含0.1%DMSO的培养基，给药组加入含有不同浓度5HPMF的培养基(10、30 μmol/L)。于37℃，5%CO2条件下孵育72h。吸走上清液，每孔加入1mL胰蛋白酶消化贴壁细胞，培养基终止反应，制成细胞悬液。用血球计数板计数，并记录每孔细胞数量。

1.3 GAGs的提取

药物作用72h，根据每个皿内培养基的体积，调整氢氧化钠溶液终浓度为100mmol·L-1，于4℃冰箱内反应6h，调整pH为6.0。每个样品中加入0.04g蛋白酶K，摇匀，置37℃恒温过夜反应，100℃水浴灭活，4500r/min离心15min，取上清，调整pH至6.0，加入100μL浓度为20mg/mL的糖原，混匀。加入保存于0.25mol/LNaCl缓冲液的离子交换树脂600μL，置摇床上旋转1.5h。自然沉降后，吸去上清。先用0.25mol/LNaCl缓冲液低盐洗脱非GAGs杂质，再用浓度为1.0mol/LNaCl缓冲液高盐洗脱GAGs样品，重复两次，每次用1mL。加入无水乙醇至高盐洗脱液中使乙醇终浓度为80%，置于4℃冰箱醇沉过夜。4500r·min-1离心15 min，倒去上清。加入10mL 75%的乙醇洗涤沉淀。600 μL双蒸水少量多次溶解并转移样品至1.5 mL EP管中，冻干备用。

1.4 GAGs单糖降解、PMP-衍生、HPLC测定单糖组成

将每组GAGs样品分别加入40μL双蒸水溶解，取8 μL加入500μL浓度为6 mol/L的盐酸中并于密封的安剖瓶中反应3h，100℃。冷却至室温转移至1.5mL离心管中，离心浓缩除去盐酸至干。用50μL双蒸水溶解样品，再加入50μL浓度为0.3mol/L的氢氧化钠溶液，室温放置10min。之后加入60 μL浓度为0.5mol·L-1的PMP涡旋均匀，于水浴70℃下反应1h。冷却至室温，加入50μL浓度为0.3 mol·L-1的盐酸，混悬。再用500μL 氯仿萃取，离心(13000r/min，5min)，吸弃氯仿层，重复萃取4次，收集上层液体即为单糖PMP衍生样品。色谱柱：EclipseXDB-C18谱柱(150mm×4.6mm×5μm，美国Agilent公司)；柱温：37℃；紫外检测波长：245nm；流动相：0.1 mol·L-1乙酸铵缓冲液(pH=5.5)：乙腈(梯度洗脱)；流速：1 mL/min；进样体积：20μL。

1.5 FGF/FGFR介导的BaF3细胞增殖实验

BaF3细胞是一种依赖于细胞因子IL-3生长的淋巴细胞，它本身对FGF蛋白无反应活性。当被稳定转染表达FGFRs，BaF3细胞可在不含IL-3细胞因子而只含有FGF和肝素的培养基中生长，而只有FGF或GAGs存在时BaF3细胞将停止生长甚至死亡[29]。在本实验中，BaF3(FGFR2b)细胞由美国华盛顿大学的David Ornitz教授友情赠送。细胞培养条件为含10%FBS，1ng/mL IL-3(PeproTech Inc)，2 mmol·L-1L-谷氨酰胺，青霉素(50 IU/mL)，链霉素(50 μg/mL)，50 μmol·L-1β-巯基乙醇，400 μg/mL G418的RPMI 1640培养基，37 ℃，5%CO2。收集BaF3细胞，离心，PBS洗3次以去掉培养基中IL-3细胞因子，重悬于含5%FBS、GAGs、FGFs的培养基中。将细胞种于96孔板(3×104细胞/孔，200 μL)，37 ℃孵育40 h，再加刃天青溶液(2 mg/mL)20 μL/孔，于细胞培养箱中孵育16 h。在全波段酶联免疫检测仪上，544～595 nm波长条件下测定各孔荧光强度，记录结果，并计算测定GAGs样品对BaF3细胞的增值率。其中肝素为阳性对照(Heparin)，透明质酸(HA)为阴性对照。

1.6 GAGs·FGFs·FGFRs三元复合物荧光强度的检测

取20 μL细胞悬液(细胞总数为1.5×106个)，加入0.5 μgFGF因子、1 μgFGFR(IIIc)/Fc、4 μg protein A-Alexa Fluor 488，避光孵育15min，1800r/min离心2min，吸走上清， 1 mLPBS清洗两次，500μL PBS(含10%FBS)重悬细胞，流式细胞仪于495和525nm处检测。根据实验需要设置FGFR阴性对照组和ProteinA阴性对照组。

2 结果

2.1 5HPMF对细胞生长的影响

GAGs总量与相应的细胞数量密切相关，因此空白对照组和5HPMF作用组细胞数相同是本实验的关键点。鉴于此，首先根据细胞增殖实验检测5HHMF作用48 h后给药组活细胞数与空白对照组活细胞数之间的比例，通过固定空白对照组的细胞数及培养皿的个数，来调整5HPMF作用组的培养皿数。例如，对HCT116细胞而言，空白对照组的培养皿(15cm)数量为4个，5HPMF浓度为30μmol·L-1作用48 h后活细胞数为空位对照的25%，为保证提取GAGs前两组具有相同的细胞数，因此调整5HPMF浓度为30μmol·L-1的培养皿数量为10个。为降低FBS中的GAGs对实验结果的影响，空白对照组和5HPMF处理组总的培养基数量相同，均为120 mL(见表1)。

注：实验重复3次。The data was repeated for 3 times.

2.2 BaF3细胞模型检测GAGs对FGF/FGFR信号通路的影响

结构不同的GAGs可激活或抑制BaF3(FGFR2b)细胞模型中特异性的FGF/FGFR信号通路，研究表明，GAGs的硫酸化程度在此过程中起关键作用[26]。为探讨5HPMF对结肠癌和肺癌细胞表面GAGs结构的影响，将5HPMF作用后的GAGs，FGF及BaF3(FGFR2b)细胞共孵育，并利用刃天青法检测5HPMF作用后的GAGs对FGF介导的BaF3(FGFR2b)细胞生长的影响。本实验以硫酸多糖肝素为阳性对照，非硫酸化多糖透明质酸为阴性对照。如图所示，肝素可显著地增加FGF1、FGF8介导的BaF3(FGFR2b)细胞生长，与之相反，透明质酸对以上FGFs介导的细胞生长无影响。如图1A所示，HT29细胞来源的GAGs样品可显著地激活FGF1介导的FGFR2b信号通路，且强于阳性药，而5HPMF作用后可对此信号通路产生不同程度的抑制作用，相比而言，A549细胞来源的GAGs可产生相似的效应。如图1B所示，HT29和A549来源的GAGs对FGF8介导的FGFR信号通路无明显影响。由检测结果可推测，5HPMF作用后可能改变了肿瘤细胞GAGs的硫酸化程度。具体结果还需进一步验证。

(以上数据来源刃天青检测方法，实验重复3次。 The cell proliferation was determined by resazurin assay following 40 h in culture (see “Materials and Methods”). Data are mean± range of triplicates.)

图1 5HPMF作用后的GAGs对FGFs介导的BaF3细胞生长的影响

Fig.1 The effect of 5HPMF treated GAGs on the growth of BaF3cell line.

2.3 5HPMF抑制FGF2和FGF8介导的GAGs·FGFs·FGFRs三元复合物的形成

如图2A-C所示，5HPMF显著地降低了HCT116细胞表面FGF2和FGF8介导及A549细胞表面FGF8介导的GAGs·FGF·FGFR三元复合物的荧光强度。而对HCT116细胞表面FGF7，FGF9和FGF10介导的GAGs·FGF·FGFR三元复合物的荧光强度无明显影响(见图2D)。研究表明，GAGs与FGF2结合主要依赖于2-O-硫酸化IdoUA残基[30]，FGF8与GAGs的结合需要具备N-，2-O-，6-O-硫酸化取代基，并且FGFs与GAGs的结合与GAGs结构域的长度也直接相关[31]。由检测结果可知，5HPMF可能影响HCT116人结肠癌和A549人肺癌细胞表面GAGs的硫酸化方式或含量。具体结果还需要进一步证实。

2.4 5HPMF对HCT116和A549细胞GAGs含量的影响

本研究利用盐酸降解、PMP标记、HPLC分析技术检测了5HPMF对HCT116和HT29细胞GAGs中葡萄糖胺(GlcN)和半乳糖胺(GalN)含量的影响，由于GlcN和GalN分别是硫酸乙酰肝素(HP)和硫酸软骨素(CS)的重要组成部分，所以GlcN和GalN的含量变化可表征相应的HP和CS的含量变化。表2.A(HCT116人结肠癌细胞)和表2.B(A549人肺癌细胞)为HPLC测定的原始数据。由表2.C可知，A549细胞中GlcN和GalN浓度显著高于HCT116细胞。对HCT116和A549两种细胞而言，相对于空白对照，浓度为10μmol·L-1时，GlcN和GalN的浓度均有升高趋势，但是浓度为30μmol·L-1时，GlcN和GalN的浓度均与空白对照相当。并且GalN/GlcN比值呈现相似的变化趋势。由此可知，5HPMF对GAGs中GlcN和GalN的含量无显著影响，也即5HPMF对HCT116和A549两种细胞的GAGs含量无显著影响。

(F2代表FGF2；F8代表FGF8；R1/Fc代表FGFR1b (IIIc)/Fc；R3/Fc代表FGFR3 (IIIc)/Fc；5HPMF的浓度为30μmol·L-1，实验重复3次。Data are mean± range of duplicates. Cells were analyzed using the Beckman cell analyzer FC500-mpl and data were processed using Beckman CXP software.F2, FGF2; F8, FGF8; R1/Fc, FGFR1b (IIIc)/Fc; R3/Fc, FGFR3 (IIIc)/Fc; 5HPMF, 30μmol·L-1. the data ware repeated for 3 times.)

图2 5HPMF对HCT116和A549细胞FGFs/FGFR/GAGs三元复合物荧光强度的影响

Fig.2 Effects of 5HPMF on FGFs/FGFR interaction with GAGs in HCT116 and A549 cell lines

3 讨论

黄酮类化合物具有广泛的生物活性包括抗肿瘤，抗心脑血管病，抗细菌病毒、抗氧化、降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、泻下、镇咳、祛痰、解痉及抗变态等。5HPMF是从中药陈皮中分离得到的一种结构新颖的黄酮类化合物，目前对其活性报道较少。前期研究表明5HPMF可显著地抑制结肠癌和肺癌细胞增殖，其作用机制主要是通过改变多种调控细胞周期和细胞凋亡的重要蛋白如p21，CyclinD1，Caspase-3，PARP，Bax等水平起到抗细胞增殖的作用。据报道，黄酮类化合物可调节GAGs的合成与代谢。5HPMF通过干预细胞内多种信号通路进而抑制肺癌和结肠癌细胞增殖。然而，5HPMF如何影响GAGs合成进而介导信号转导通路的机制还不清楚。

GAGs是细胞膜和胞外基质的重要组成成分，可与多种生长因子结合进而介导细胞信号传导过程。本研究以肿瘤细胞GAGs为切入点，以5HPMF为研究对象，探讨了5HPMF对肺癌和结肠癌细胞表面GAGs含量和结构的影响，研究发现，来源于HT29和A549细胞的GAGs可增强FGF1介导的BaF3细胞生长而5HPMF(10 μmol/L)则显著地抑制其生长作用，且5HPMF可显著地降低HCT116和A549细胞表面FGF2或FGF8介导的GAGs·FGF·FGFR三元复合物的荧光强度，但是5HPMF对GAGs含量无明显影响，由此可推断5HPMF可能通过影响肺癌和结肠癌细胞表面GAGs结构而介导细胞内部信号转导。

同时，本研究建立了一种定性检测肿瘤细胞表面GAGs结构或含量变化的方法，该方法基于肿瘤细胞表面GAGs可与FGF/FGFR结合进而形成GAGs·FGFs·FGFRs三元复合物，而FITC-protein A识别FGFR/Fc上的Fc片段进而使三元复合物具备荧光特性，而GAGs结构或含量的变化可直接影响GAGs/FGF/FGFR三元复合物的荧光强度。该方法的优点在于：①荧光检测敏感度较高，GAGs结构微量变化即可反映；②重复性高，可信度高，应用此方法我们初步判定5HPMF改变了肺癌和结肠癌细胞表面GAGs的结构，但是具体硫酸化位点的变化或硫酸化程度的改变还需结合还需结合LC/MS技术进一步进行检测。

在本研究中采用盐酸降解GAGs单糖而非三氟乙酸降解法，因为来自肿瘤细胞的GAGs样品量少，且含有蛋白质等杂质，且这些杂质在一定程度上影响样品分析的准确性。如果采用三氟乙酸这种温和的降解条件，虽然可以得到木糖、葡萄糖、甘露糖等更多单糖组分的信息，但由于降解不完全，每种单糖的检测限都较低。本课题主要是研究5HPMF对GAGs总量(也即HS和CS的含量)的影响，盐酸降解特异性强，降解产物只有GlcN和GalN，由于以上两种单糖分别为HS和CS的重要组成部分，且其含量变化可表征相应的HS和CS的含量变化，因此盐酸降解法完全可满足本研究的要求。GAGs一般无特征紫外吸收，所以在HPLC中无法直接检测。经PMP衍生后具有较强的紫外吸收，提高了GlcN和GalN在HPLC中的检测灵敏度。PMP衍生的优点在于温和条件下与GAGs还原糖链进行定量反应，不损失唾液酸，产物没有立体异构体，紫外吸收很强，检测限很低，可达pmol级，此外PMP衍生后的单糖疏水性提高，且衍生化产物带电荷，分析时可使用多种分离模式。

总之，本研究阐明5HPMF抗结肠癌和肺癌细胞增殖主要是通过改变了结肠癌和肺癌细胞表面GAGs的结构而非含量，关于5HPMF对结肠癌和肺癌细胞表面GAGs硫酸化位点和硫酸化程度的改变还需结合LC/MS进一步检测。

[1] Filmus J. Glypicans in growth control and cancer[J]. Glycobiology, 2001, 11(3): 19-23.

[2] Sanderson R D. Heparan sulfate proteoglycans in invasion and metastasis[J]. Semin Cell Dev Biol, 2001, 12(2): 89-98.

[3] Liu D, Shriver Z, Qi Y, et al. Dynamic regulation of tumor growth and metastasis by heparan sulfate glycosaminoglycans[J]. Semin Thromb Hemost, 2002, 28(1): 67-78.

[4] Iozzo R V, San A J. Heparan sulfate proteoglycans: heavy hitters in the angiogenesis arena[J]. J Clin Invest, 2001, 108(3): 349-355.

[5] Smorenburg S M, Van Noorden C J. The complex effects of heparins on cancer progression and metastasis in experimental studies[J]. Pharmacol Rev, 2001, 53(1): 93-105.

[6] Varki N M, Varki A. Heparin inhibition of selectin-mediated interactions during the hematogenous phase of carcinoma metastasis: rationale for clinical studies in humans[J]. Semin Thromb Hemost, 2002, 28(1): 53-66.

[7] Iozzo R V, Wight T N. Isolation and characterization of proteoglycans synthesized by human colon and colon carcinoma[J]. J Biol Chem, 1982, 257(18): 11135-11144.

[8] Lv H, Yu G, Sun L, et al. Elevate level of glycosaminoglycans and altered sulfation pattern of chondroitin sulfate are associated with differentiation status and histological type of human primary hepatic carcinoma[J]. Oncology, 2007, 72(5-6): 347-356.

[9] Takeuchi J, Sobue M, Sato E, et al. Variation in glycosaminoglycan components of breast tumors[J]. Cancer Res, 1976, 36(7 PT 1): 2133-2139.

[10] Theocharis A D, Vynios D H, Papageorgakopoulou N, et al. Altered content composition and structure of glycosaminoglycans and proteoglycans in gastric carcinoma[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2003, 35(3): 376-390.

[11] Iida S, Suzuki K, Matsuoka K, et al. Analysis of glycosaminoglycans in human prostate by high-performance liquid chromatography[J]. Br J Urol, 1997, 79(5): 763-769.

[12] Theocharis A D, Tsara M E, Papageorgacopoulou N, et al. Pancreatic carcinoma is characterized by elevated content of hyaluronan and chondroitin sulfate with altered disaccharide composition[J]. Biochim Biophys Acta, 2000, 1502(2): 201-206.

[13] Tsara M E, Papageorgacopoulou N, Karavias D D, et al. Distribution and changes of glycosaminoglycans in neoplasias of rectum[J]. Anticancer Res, 1995, 15(5B): 2107-2112.

[14] Wegrowski Y, Maquart F X. Involvement of stromal proteoglycans in tumour progression[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2004, 49(3): 259-268.

[15] Wang C, Tammi M, Guo H, et al. Hyaluronan distribution in the normal epithelium of esophagus, stomach, and colon and their cancers[J]. Am J Pathol, 1996, 148(6): 1861-1869.

[16] Ponting J, Howell A, Pye D, et al. Prognostic relevance of serum hyaluronan levels in patients with breast cancer[J]. Int J Cancer, 1992, 52(6): 873-876.

[17] Pan J, Qian Y, Weiser P, et al. Glycosaminoglycans and activated contact system in cancer patient plasmas[J]. Prog Mol Biol Transl Sci, 2010, 93: 473-495.

[18] Tanner Y, Grose RP. Dysregulated FGF signalling in neoplastic disorders[J]. Semin Cell Dev Biol, 2015, pii: S1084-9521(15)00209-8.

[19] Flippot R, Kone M, Magné N, et al. FGF/FGFR signalling: Implication in oncogenesis and perspectives[J]. Bull Cancer， 2015, 102(6): 516-526.

[20] Kloska A, Jakóbkiewicz-Banecka J, Narajczyk M, et al. Effects of flavonoids on glycosaminoglycan synthesis: implications for substrate reductiontherapy in Sanfilippo disease and other mucopolysaccharidoses[J]. Metab Brain Dis， 2011, 26(1): 1-8.

[21] Chatzinikolaou G, Nikitovic D, Stathopoulos EN, et al. Protein tyrosine kinase and estrogen receptor-dependent pathways regulate the synthesis and distribution of glycosaminoglycans/proteoglycans produced by two human colon cancer cell Lines[J]. Anticancer Res， 2007, 27(6B): 4101-4106.

[22] Nikitovic D, Tsatsakis AM, Karamanos NK, et al. The effects of genistein on the synthesis and distribution of glycosaminoglycans/proteoglycans by two osteosarcoma cell lines depends on tyrosine kinase and the estrogen receptor density[J]. Anticancer Res, 2003, 23(1A): 459-464.

[23] Mitropoulou T N, Tzanakakis G N, Nikitovic D, et al. In vitro effects of genistein on the synthesis and distribution of glycosaminoglycans/proteoglycans by estrogen receptor-positive and -negative human breast cancer epithelial cells[J]. Anticancer Res， 2002, 22(5): 2841-2846.

[24] Qiu P, Guan H, Dong P, et al. The inhibitory effects of 5-hydroxy-3, 6, 7, 8, 3', 4'-hexamethoxyflavone on human colon cancer cells[J]. Mol Nutr Food Res, 2011, 55(10): 1523-1532.

[25] Qiu P, Guan H, Dong P, et al. The p53-, Bax-and p21-dependent inhibition of colon cancer cell growth by 5-hydroxy polymethoxyflavones[J]. Mol Nutr Food Res, 2011, 55(4): 613-622.

[26] Qiu P, Dong P, Guan H, et al. Inhibitory effects of 5-hydroxy polymethoxyflavones on colon cancer cells[J]. Mol Nutr Food Res, 2010, 54 Suppl 2: S244-S252.

[27] Dong P, Qiu P, Zhu Y, et al. Simultaneous determination of four 5-hydroxy polymethoxyflavones by reversed-phase high performance liquid chromatography with electrochemical detection[J]. J Chromatogr A, 2010, 1217(5): 642-647.

[28] Xiao H, Yang C S, Li S, et al. Monodemethylated polymethoxyflavones from sweet orange (Citrussinensis) peel inhibit growth of human lung cancer cells by apoptosis[J]. Mol Nutr Food Res, 2009, 53(3): 398-406.

[29] Pan J, Qian Y, Zhou X, et al. Chemically oversulfated glycosaminoglycans are potent modulators of contact system activation and different cell signaling pathways[J]. J Biol Chem， 2010, 285(30): 22966-22975.

[30] Kreuger J, Salmivirta M, Sturiale L, et al. Sequence analysis of heparan sulfate epitopes with graded affinities for fibroblast growth factors 1 and 2[J]. J Biol Chem, 2001, 276(33): 30744-30752.

[31] Loo B M, Salmivirta M. Heparin/Heparan sulfate domains in binding and signaling of fibroblast growth factor 8b[J]. J Biol Chem， 2002, 277(36): 32616-32623.

责任编辑 徐 环

The Quantitative and Qualitative Alterations of GAGs Induced by 5-Hydroxyed Nobiletin in Cancer Cells

CUI Yi-Di, TANG Yang, HAN Zhang-Yun, ZENG Xuan, XU Ling-Ling, ZHANG Li-Juan, QIU Pei-Ju

(Key Laboratory of Marine Drugs, Ministry of Education, School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266033, China; Shanclong Provincial Key Laboratory of Glycoscience and Glycoengineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Quantitative and qualitative alterations of glycosaminoglycans (GAGs) play a critail role in the development and progression of cancer. 5-hydroxyed nobiletin (5HPMF) which was isolated from the peel of orange exhibited significantly inhibitory effect on colon cancer cells growth. So far, there are no reports about the effect on how 5HPMF modulates the synthesis and alters the fine structure of GAGs. To this end, the study focused on the determination of the quantitative and qualitative alterations of GAGs induced by 5HPMF,using BaF3 cell model, Flow cytometry and HPLC. The data shown that the GAGs obtained from HT29 and A549 cells significantly enhanced FGF1mediated cell growth in BaF3model, however, the treatment of 5HPMF(10 μmol·L-1)attenuated the effect. Moreover, 5HPMF significantly decreased the fluorescence intensity of FGF2 and FGF8 mediated ternary complex. But no significant alternation on the content of chondroitin sulfate and heparan sulfate induced by 5HPMF was observed based on the data from HPLC. Taken together, we presumed 5HPMF induced the alternation in structure rather than in content of GAGs of lung and colon cancer cells to mediate the signaling transduction. The results provide experimental foundation for further exploring the correlation between the inhibitory effect of cancer cell growth and the alteration of content and sulfation induced by 5HPMF.

glycosaminoglycans； 5-hydroxyed nobiletin; fluorescence intensity； FGF； FGFR

教育部新教师基金项目(20130132120006)；山东省科技发展计划项目(2012GSF11912&2014GGH215001)资助

2015-10-22；

2016-03-30

崔怡迪(1991-)，女，硕士生。E-mail：yidi717@126.com

** 通讯作者：E-mail：grfqiupeiju@hotmail.com

R962

A

1672-5174(2017)04-066-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20150362

崔怡迪， 唐洋， 韩章润, 等.5-羟基川陈皮素对肿瘤细胞糖胺聚糖含量和结构的影响[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版)， 2017, 47(4): 66-72.

CUI Yi-Di, TANG Yang, HAN Zhang-Yun, et al. The quantitative and qualitative alterations of GAGs induced by 5-Hydroxyed nobiletin in cancer cells[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(4): 66-72.

Ministry of Education New Teacher’s Fund(20130132120006)； Shandong Science and Technology Development Planning Project(2012GSF11912&2014GGH215001)