基于高通量测序的青石斑鱼基因组微卫星开发及评价*

高峰涛， 邵长伟， 崔忠凯， 王升鹏， 魏 敏， 陈松林**， 杨官品

(1.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003；2.中国水产科学院黄海水产研究所，农业部海洋渔业可持续利用重点实验室，山东 青岛 266071；3.青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266237)

基于高通量测序的青石斑鱼基因组微卫星开发及评价*

高峰涛1,2,3， 邵长伟2,3， 崔忠凯2,3， 王升鹏2,3， 魏 敏2,3， 陈松林2,3**， 杨官品1

(1.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003；2.中国水产科学院黄海水产研究所，农业部海洋渔业可持续利用重点实验室，山东 青岛 266071；3.青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266237)

本研究采用基因组高通量随机测序的方法对青石斑鱼(Epinephelusawoara)微卫星标记进行了发掘， 结果共获得青石斑鱼(Epinephelusawoara)基因组原始数据 2.860 G。采用MISA (MIcroSAtellite) 软件进行微卫星位点搜索，获得967 657条微卫星序列。随机选取了96条微卫星序列设计引物并利用8尾青石斑鱼个体进行多态性位点筛选，共获得60个具有多态的微卫星标记。利用其中16个微卫星标记对一个青石斑鱼亲鱼群体的种群遗传学特征进行评价，共检测到129 个等位基因，单个标记的表观等位基因数(NA) 分布范围为2～14，平均为7.167；表观杂合度(HO) 分布范围为0.422～1.000，平均为0.678 6；期望杂合度(HE) 分布范围为0.481～0.893，平均为0.676 8。有5个标记的等位基因频率不符合“哈迪-温伯格平衡”，其中EAW-55596、EAW-21755、EAW-30334 3个标记表现为杂合子显著缺失(P<0.05)，而EAW-33674和EAW-52520 2个标记表现为杂合子显著过剩(P<0.05)。连锁不平衡检测表明各位点间无连锁不平衡现象。多态信息含量(PIC)分布范围为0.362 3～0.872 2，平均PIC=0.639 7>0.5，说明该亲鱼群体的遗传多样性比较高。而这些微卫星标记将对于青石斑鱼的遗传变异分析、亲缘关系鉴定提供了技术支持，这也将为青石斑鱼的分子遗传育种奠定了基础。

青石斑鱼；高通量测序；微卫星标记；多态性；群体遗传评价

青石斑鱼(Epinephelusawoara) 隶属于鲈形目(Perciforme)，鮨科 (Serranidae)，石斑鱼亚科 (Epinephelinae)，石斑鱼属(Epinephelus)，主要分布于北太平洋西部，中国则分布于南海及东海南部[1-3]，青石斑鱼，肉质细腻，味道鲜美、目前中国产出的青石斑鱼已远销国外，不仅畅销而目售价甚高，为海产名贵鱼类之一[4]。作为一种重要的海水经济鱼类，青石斑鱼的分子标记开发却非常有限[5]，Upadhyay参考东大西洋石斑鱼等近缘物种的微卫星序列所开发获得了23条青石斑鱼微卫星标记[6]。Upadhyay利用RAPD技术对青石斑鱼的两个群体的遗传多样性进行了分析[7]。董秋芬等[8]、刘丽等[9]利用构建小片段基因组DNA文库，筛选获得了96条微卫星序列。Zhao等[10]通过生物素-磁珠吸附微卫星富集法(FISCO)获得了56 条青石斑鱼微卫星序列。在《2015年世界自然保护联盟受威胁种群红色目录》中青石斑鱼仍被列为研究数据缺乏的物种[11]。而微卫星作为一种共显性标记在基因组内均匀分布，数量多，多态性信息丰富，易于检测，也是目前对海洋生物遗传多样性分析研究中使用最为广泛的分子标记[12]。因此大量发掘青石斑鱼的微卫星标记，并以此建立青石斑鱼类种质资源分析和评价技术体系，对于更好地开发利用优良性状种质资源具有重大意义。

本研究利用高通量随机测序的方法对青石斑鱼进行了微卫星标记挖掘，并利用多态微卫星标记对一个青石斑鱼亲鱼群体进行种群遗传学特征评价，以期为青石斑鱼的分子辅助育种提供帮助，为培育优质、高产、抗逆、抗病的青石斑鱼优良品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验中所用的青石斑鱼为大华农水产有限公司(广州)亲鱼群体。剪取尾部鳍条少许于离心管中，加入无水乙醇，置于-20 ℃ 保存。

1.2 基因组DNA的提取

使用“OMEGA 组织DNA提取试剂盒”对样品的基因组DNA 进行提取(具体操作方法参照说明书，略有改动)。经1%的琼脂糖凝胶电泳对样品DNA 进行检测，置于-20 ℃ 保存备用。

1.3 高通量测序与微卫星位点的挖掘

使用HiSeq4000 高通量测序仪 (Illumina，USA) 对青石斑鱼基因组DNA 进行“全基因组随机测序” (测序服务由上海美吉生物医药科技有限公司提供)。过滤掉接头、低质量序列后使用MISA (MIcroSAtellite) (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)软件搜索微卫星位点[13]。

1. 4 引物设计与筛选

使用Premier 5.0 软件在微卫星侧翼序列上设计引物。所设计引物的主要参数: GC 含量：45%～55%；引物长度：18～25 bp，退火温度：55～60 ℃，预期产物长度130～300 bp。所设计引物交由北京金唯智生物公司合成。

随机选取青石斑鱼亲鱼群体中的8尾个体的基因组DNA 作为模板，对合成的引物进行多态性筛选，并优化反应条件[14]。PCR 反应体系为15 μL，其中包括10×PCR Buffer(Mg2+) 1.5 μL， dNTP(2.5 mmol·μL-1) 1.2 μL， 上、下游引物各0.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1) (Takara，大连) 0.3 μL， DNA模板1 μL，灭菌去离子水 10 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环; 72 ℃延伸10 min；4 ℃ 保存。PCR产物经6%聚丙烯凝胶电泳进行等位基因分型，并由硝酸银染色，显色，数码相机拍照保存。

1. 5 青石斑鱼亲鱼群体的种质遗传学评价

随机挑选48尾青石斑鱼的亲鱼基因组DNA作为模板，用16个具有多态的微卫星标记进行种群的遗传学特征评价(见表1)。采用的PCR体系、条件及基因分型方法同上述。校正电泳偏差识别并统计等位基因。使用软件GENEPOP3.4 计算各位点是否符合“哈迪-温伯格平衡”[15]，并用Bonferroni予以校正[16]，使用软件FSTAT2.9.4计算各位点间的连锁不平衡关系[17]，使用软件Popgen32计算每个标记的等位基因数(Number of alleles,NA)、有效等位基因数(Effective number of alleles,NE)表观杂合度(Observed heterozygosity,HO)、期望杂合度(Expected heterozygosity,HE)和多态信息含量(Polymorphism Information Content,PIC)等种群遗传学特征值[18]。

2 结果

2.1 高通量测序和微卫星位点搜索

对青石斑鱼进行基因组随机高通量测序，共获得原始序列数据2.860 Gbp。过滤掉接头、低质量序列后，采用MISA (MIcroSAtellite)软件进行微卫星位点搜索，获得967 657条微卫星序列(未公开)。

2.2 PCR引物设计和筛选

随机挑选96条微卫星序列并设计引物，以8尾青石斑鱼个体的基因组DNA 为模板，对设计的PCR 引物进行筛选，共筛选到具有多态性的位点的引物60对。

2.3 基于微卫星标记的种群遗传学评价

随机选取16个微卫星标记对青石斑鱼亲鱼群体进行种群遗传学评价(见图1)。其中共检测到129 个等位基因。单个标记的表观等位基因数(NA) 分布范围为2～14，平均为7.167；表观杂合度(HO) 分布范围为0.422～1，平均为0.678 6；期望杂合度(HE) 分布范围为0.481～0.893，平均为0.676 8(见表2) 。“哈迪-温伯格平衡”检验的结果表明，经Bonferroni校正后有5个标记的等位基因频率不符合“哈迪-温伯格平衡” (见表2) 。连锁不平衡检测的结果表明，所有标记对间均不存在连锁不平衡现象。

3 讨论

3.1 高通量测序技术在发掘微卫星序列的优越性

传统的微卫星分离技术包括小片段DNA克隆法和微卫星富集文库法[19]。Upadhyay参考东大西洋石斑鱼等近缘物种的微卫星序列所开发获得了23条青石斑鱼微卫星标记[6]。董秋芬等[8]、刘丽等[9]利用构建小片段基因组DNA文库，筛选获得了96条微卫星序列。Zhao等[10]通过FISCO法获得了56 条青石斑鱼微卫星序列。上述开发的微卫星标记虽然在一定程度上可以满足诸如种群遗传多样性评估、遗传结构分析、亲缘关系鉴定等工作，但远不能满足如连锁图谱构建、QTL精细定位及分子辅助育种等对分子标记需求量较大的研究需要[14，20]。随着测序成本的降低及测序平台通量的不断扩大，利用二代测序技术对基因组进行随机测序即可获得海量的微卫星序列，具有通量大、周期性短的特点。而本研究利用了HiSeq4000 高通量测序仪进行基因组测序，其测序通量达到了1.5 T/run，同时测序读长达到2×150 bp；测序速度达到3.5 d/run，体现出了明显的技术优势[21]，获得了967 657 条青石斑鱼微卫星序列，这对于筛选高质量多态性的微卫星标记以及后续的良种选育工作提供了重要保障。

3.2 青石斑鱼亲鱼群体的种群遗传学特征

本研究所用的青石斑鱼群体为大华农水产有限公司(广州)的亲鱼群体，是由取自南海五个不同的海域石斑鱼个体组成，随机选取了48尾作为实验样本，经Bonferroni校正后有5个标记的等位基因频率不符合“哈迪-温伯格平衡”。其中EAW-55596、 EAW-21755、EAW-30334 3个标记表现为杂合子显著缺失(P<0.05)，而EAW-33674和EAW-52520 2个标记表现为杂合子显著过剩(P<0.05)，其中分析原因一方面可能是由于过度捕捞、生态条件恶化等造成了野生石斑鱼数量减少或一定程度上的种质退化，致使其种群结构受到影响[22]。另外，该群体是由取自5个不同海域个体组成，人为干扰因素较大，导致多个基因频率不符合“哈迪-温伯格平衡”。

注：PHWE.“哈迪-温伯格”平衡显著性检验P值; *.经过“sequential Bonferroni”校正后仍然背离“哈迪-温伯格定律”校正P≤0.05 ；**.P≤0.01。PHWE. Hardy-Weinberg probability test; *.Locus deviated from Hardy-Weinberg proportions adjustedP-value≤0.05；**.P≤0.01 EAW-33674， EAW-52520.

本研究中利用16个微卫星位点在青石斑鱼群体共检测到129个等位基因。单个标记的表观等位基因数(NA) 分布范围为2～14，平均为7.167，均大于董秋芬等[8]、刘丽等[9]，Zhao等[10]所采用青石斑鱼群体的平均等位基因个数(分别为3.69和4.83),说明本研究中所应用的微卫星标记在此青石斑鱼群体中已表现出较高的长度多样性和优良的遗传素质，能够为青石斑鱼种群的遗传多样性评价、亲缘关系鉴定等提供良好的技术基础。群体杂合度是反映群体在多个基因上的遗传变异及群体遗传多样性丰富度。群体杂合度越高，表明该群体的遗传变异越多，群体遗传多样性越高[23]该群体的表观杂合度(HO) 分布范围为0.391～1；期望杂合度(HE) 分布范围为0.481～0.893。平均期望杂合度(HE)为0.676 8，平均观测杂合度(HO)为0.678 6，与Zhao等[10]所采用青石斑鱼群体类似(平均HE为0.663 3，平均HO为0.718 3)，却高于董秋芬等[8]、刘丽等[9]所采用青石斑鱼群体(平均HE为0.507 8，平均HO为0.598 2)；本实验群体的PIC分布范围为0.362 3～0.872 2，平均PIC=0.639 7>0.5，也高于董秋芬等[8]、刘丽等[9]所采用的青石斑鱼群体(平均PIC=0.472 2)。上述结果说明本研究中所用的青石斑鱼亲鱼群体的遗传多样性比较高。这对于指导该亲鱼群体的人工繁育，合理避免近亲交配，保护和利用群体的遗传多样性，促进是优良种质的获得以及青石斑鱼人工繁育产业的持续健康发展具有重要意义。

4 结语

本研究通过对青石斑鱼基因组随机测序获得了的967 657 条微卫星序列，与传统方法相比，具有明显的优势，今后将成为开发微卫星主要的技术手段。随机选取了96条微卫星序列设计引物进行多态性位点筛选，共获得60个具有多态的微卫星标记。利用开发的16个微卫星标记对一个青石斑鱼亲鱼群体进行了遗传多样性分析研究，证明了该石斑鱼亲鱼群体的遗传多样性比较高，且本研究中所开发的青石斑鱼微卫星标记在测试群体中表现出较高的片段长度多样性和优良的遗传素质，能够为青石斑鱼种群的遗传多样性评价、种群遗传评价等提供良好的技术基础。

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责任编辑 高 蓓

Development and Population Genetic Diversity Analysis of Microsatellite Markers inEpinephelusawoara

GAO Feng-Tao1,2,3，SHAO Chang-Wei2,3，CUI Zhong-Kai2,3，WANG Sheng-Peng2,3，WEI Min2,3，CHEN Song-Lin2,3，YANG Guan-Pin1

(1.College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (CAFS), the Key Laboratory for Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Qingdao 266071, China; 3.Laboratory for Marine Fisheries, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology， Qingdao 266237, China)

In this study，The microsatellites ofEpinephelusawoarawere isolated， and the genetic diversity were analysed. Firstly, High throughput sequencing technology was used to develop microsatellites ofEpinephelusawoara, and 2.860 Gbp raw data was obtained. Microsatellites were identified by screening the genome sequences using software MISA(MIcroSAtellite), and 967 657 different kinds of repeat motif types of microsatellite sequences were discovered. Ninety-six pairs of primers were designed according to unique microsatellite flanking sequences for amplification by polymerase chain reaction (PCR) with the software Primer 5.0, among which 60 loci were clearly amplified and shown polymorphic. In this paper, 16 polymorphic microsatellite loci were characterized to evaluate the genetic diversity of parent population (48 individuals included) ofEpinephelusawoara. A total of 129 alleles were detected, the number of alleles per loci ranged from 4 to 14 and effective number of alleles ranged from 1.905 9 to 8.295 3 with the average of 7.166 7 and 4.241 1, respectively. The observed heterozygosities (HO) were from 0.422 to 1.000 (mean=0.678 6), and the expected heterozygosities (HE) ranged from 0.481 to 0.893 (mean=0.676 8). Five loci deviated significantly from the Hardy-Weinberg equilibrium. Three markers indicated significant heterozygote deficiency including EAW-55596, EAW-21755 and EAW-30334. Otherwise, EAW-33674 and EAW-52520 indicated significant heterozygote excess. And none of the loci combinations showed significant linkage disequilibrium. The polymorphism information content (PIC) was from 0.362 3 to 0.872 2 (mean=0.639 7>0.5), and this result indicated that the genetic diversity of population was at high level. Thus, these microsatellite loci first presented useful molecular markers in the analysis of the genetic variability and in the investigation of genetic relations ofEpinephelusawoara, which will provide a basis for genetic breeding.

Epinephelusawoara; high-throughput sequencing; microsatellite; polymorphism; genetic diversity of population

山东省泰山学者项目资助

2016-05-17；

2016-06-30

高峰涛(1986-)男，博士生，主要从事分子生物学及生物资源方面的研究。

** 通讯作者：E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

S917.4

A

1672-5174(2017)04-052-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20160185

高峰涛, 邵长伟, 崔忠凯, 等. 基于高通量测序的青石斑鱼基因组微卫星开发及评价[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(4): 52-57.

GAO Feng-Tao, SHAO Chang-Wei, CUI Zhong-Kai, et al. Development and population genetic diversity analysis of microsatellite markers inEpinephelusawoara[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(4): 52-57.

Supported by the Taishan Scholar Project of Shandong Province